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Conditional Knockout of the L-Type Voltage-gated Calcium Channel CaV1.3 via the FLEX Switch

Bartels, Katrin

German Title: Konditionaler Knockout des L-Typ spannungsgesteuerten Calciumkanals CaV1.3 mittels des FLEX Switch

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Abstract

L-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) play a central role in regulating intracellular calcium (Ca2+) concentrations, thereby contributing to signal transduction in many electrically excitable cells. The L-type channel CaV1.3 is expressed in neurons, in hair cells of the inner ear, in heart tissue and in pancreatic ß-cells. Mice with a ubiquitous deletion of the pore-forming alpha1-subunit (CaV1.3-/-) showed that CaV1.3 has cardiac pace maker activity and controls the neurotransmitter release in the cochlea. Furthermore, Ca2+ influx through this channel was proposed to be involved in anxiety-related behaviour and in consolidation of contextually conditioned fear. Aim of my work was to gain more insight into the physiological role of CaV1.3 in different cell types and tissues, especially in neurons. To circumvent the phenotypes of the conventional knockout mice like deafness and heart insufficiency which may interfere with behavioural analysis, we decided to generate a conditional CaV1.3alpha1 knockout mouse using the Cre/loxP-based FLEX switch system. By a Cre-mediated inversion of the targeted locus, this strategy coupled the ablation of the CaV1.3alpha1 gene to the expression of the reporter gene eGFP, thereby mirroring the exact expression pattern of the endogenous CaV1.3 gene in all tissues. Heterozygous CaV1.3-GFPflex mice were bred with “Cre-deleter” mice in which the Cre recombinase is ubiquitously expressed. We could show that, after Cre expression, the FLEX switch occurred efficiently in vitro and in vivo and that the reporter gene was driven by the endogenous CaV1.3alpha1 promoter. Immunohistochemical analysis revealed eGFP expression in heart tissue as well as in many brain areas like the olfactory bulb, the cerebellum, superior colliculus, brain regions associated with emotional behaviour and sensory processing. In contrast to previously reported CaV1.3 expression, only moderate eGFP staining was found in hippocampal regions. An unexpected observation was the intense eGFP expression in the peri- and subventricular zone, suggesting a role of CaV1.3alpha1 in adult neurogenesis and neural stem cell proliferation. In parallel, we crossed CaV1.3-GFPflex mice to CaMKIIa-mice, thereby obtaining specific eGFP expression in the forebrain according to the expression of the CaMKIIa promoter. This mouse model offers a great potential to further investigate the distribution and function of the L-type Ca2+ channel CaV1.3 in various tissues.

Translation of abstract (German)

L-typ spannungsgesteuerte Calciumkanäle (VGCC) spielen eine zentrale Rolle in der Regulierung der intrazellulären Ca2+ Konzentration und tragen somit zur Signalverarbeitung in vielen elektrisch erregbaren Zellen bei. Der L-typ Kanal CaV1.3 wird in Neuronen, in Haarzellen des Innenohrs, im Herzgewebe und in ß-Zellen des Pankreas exprimiert. Mäuse mit einer ubiquitären Deletion der porenbildenden alpha1-Untereinheit (CaV1.3-/-) zeigten, dass der CaV1.3 Kanal Herzschrittmacher-Funktionen besitzt und die Neurotransmitter-Ausschüttung in der Cochlea kontrolliert. Des Weiteren wird dieser Kanal mit dem Ängstlichkeitsverhalten und Konsolidierung von kontextabhängig konditionierter Angst in Verbindung gebracht. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Einblicke in die physiologische Rolle von CaV1.3 in verschieden Zelltypen und Geweben, im Besonderen in Neuronen, zu erhalten. Da konventionelle Knockout-Mäuse Phänotypen wie Taubheit und Herzinsuffizienz zeigen, die Verhaltensanalysen beeinträchtigen können, haben wir uns entschlossen, diese zu umgehen und eine konditionale CaV1.3alpha1 Knockout-Maus mithilfe des Cre/loxP-basierten „FLEX switch“ Systems zu generieren. Durch ein Cre-vermitteltes Invertieren des „gefloxten“ Allels koppelt diese Strategie die Inaktivierung des CaV1.3α1 Gens an die Expression des Reportergens eGFP, wodurch das exakte Expressionsmuster des endogenen CaV1.3alpha1 Gens in allen Geweben gespiegelt wird. Heterozygote CaV1.3-GFPflex Mäuse wurden mit “Cre-Deleter”-Mäusen verpaart, welche die Cre-Rekombinase ubiquitär exprimieren. Wir konnten zeigen, dass nach Cre-Expression der FLEX „switch“ in vitro und in vivo effizient erfolgte und dass das Reportergen von dem endogenen CaV1.3alpha1 Promotor getrieben wurde. Immunhistochemische Analysen ließen eGFP-Expression im Herzgewebe und vielen Hirnarealen erkennen, wie dem olfaktorischen Bulbus, Cerebellum, Superior Colliculus und Regionen, die mit emotionalem Verhalten und sensorischer Verarbeitung assoziiert sind. Im Gegensatz zu der bekannten CaV1.3 Expression, zeigte sich in den hippokampalen Hirnregionen nur eine gemäßigte eGFP-Färbung. Eine unerwartete Beobachtung war die intensive eGFP-Expression in der peri- und subventrikulären Zone, was auf eine Funktion von CaV1.3 in adulter Neurogenese und neuronaler Stammzellproliferation hinweisen könnte. Parallel verpaarten wir CaV1.3-GFPflex Mäuse mit CaMKIIa-Mäusen, wobei wir eine spezifische eGFP-Expression im Vorderhirn in Übereinstimmung mit der Expression des CamKIIa-Promoters ausmachen konnten. Das CaV1.3-GFPflex Mausmodel stellt somit ein großes Potential dar, die Funktion and Verbreitung des L-typ Kalziumkanals CaV1.3 weiter aufzuklären.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bading, Prof. Hilmar
Date of thesis defense: 29. September 2009
Date Deposited: 25. Nov 2009 13:32
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Interdisziplinäres Zentrum für Neurowissenschaften
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Knockout <Molekulargenetik>, Calciumkanal
Uncontrolled Keywords: konditionaler Knockout , CaV1.3 , spannungsgesteuerter Calciumkanal , L-Typ Calciumkanal , Cre-loxP Systemconditional knockout , voltage-gated calcium channel , L-type calcium channel , FLEX Switch
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