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Tyrosinnitrierung von CD40 als antiarteriosklerotischer Schutzmechanismus humaner Endothelzellen

Hildebrandt, Anke

English Title: Tyrosine nitration of CD40 as an anti-atherosclerotic protective mechanism of human endothelial cells

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Abstract

Die Arteriosklerose tritt im menschlichen Körper am häufigsten in mittleren und großen Arterien auf. Dabei entstehen fibröse Plaques vorzugsweise an Biegungen und Verzweigungen dieser Gefäße. Die Lokalisation der arteriosklerotischen Plaques scheint mit Bereichen verminderter laminarer Schubspannung bei gleichzeitiger zyklischer Dehnung zu korrelieren. Interaktionen von CD40 mit CD40 Ligand werden als ein wesentlicher pathogenetischer Mechanismus bei Entzündungen einschließlich der Entwicklung der Arteriosklerose angenommen. In dieser Arbeit wurde die durch zyklische Dehnung (Flexercell FX-3000) induzierte Tyrosinnitrierung von CD40, gefolgt von dessen schnellen Abbau in kultivierten humanen Endothelzellen untersucht. Die Hemmung der 20SUntereinheit des Proteasoms und die Peroxynitritscavenger Urat und FeTPPs verhinderten die dehnungsinduzierte Abnahme von CD40-Protein. Darüber hinaus war eine Tyrosinnitrierung von CD40 auch unter statischen Kulturbedingungen nach Inkubation mit exogenem Peroxynitrit oder dem Peroxynitritdonor SIN-1 nachweisbar. Weitere Untersuchungen ergaben einen signifikanten Rückgang der CD154-induziertem IL-12p40 und E-Selektin Expression auf mRNA- und Protein-Ebene nach zyklischer Dehnung oder der Exposition mit exogenem ONOO-. Dieser Effekt wurde durch eine Vorinkubation der Zellen mit Urat verhindert. Western Blot-Analysen mit immunpräzipitiertem CD40 konnten eine signifikante Abnahme der CD154-abhängigen Rekrutierung von Traf 2 und Traf 6 an CD40 nach kurzer Exposition gegenüber exogenen ONOO- nachweisen. Eine Vorinkubation der Zellen mit Urat oder die Depletierung von Cholesterin aus der Plasmamembran mit Methyl-β-Cyclodextrin stellten die CD154-vermittelte Assoziation von Traf 2 und Traf 6 mit CD40 wieder her. Zusätzliche Western Blot-Analysen ergaben eine signifikante Abnahme des CD40 Protein in der mikrosomalen Membranfraktion von HUVECs und THP-1-Monozyten nach Zugabe von exogenem ONOO-. Immunfluoreszenzfärbungen von Monozyten zeigten letztlich eine ONOO--abhängige Internalisierung von CD40 von der Plasmamembran ins Zytoplasma der Zellen, die durch Methyl-β-Cyclodextrin verhindert wurde. Dieser posttranskriptionelle Mechanismus könnte Endothelzellen u. a. vor einer Initiation und Progression der Arteriosklerose durch Kontakt mit pro-inflammatorischen CD154-positiven T-Zellen oder Thrombozyten in Regionen mit verstärktem hämodynamischen Stress schützen.

Translation of abstract (English)

Atherosclerosis is a focal disease affecting medium to large size arteries in the human body.In these vessels, fibrous plaques are preferentially located at branches and bifurcations. The localization of atherosclerotic plaques seems to correlate with areas of reduced laminar shear stress with cyclic stretch being enhanced. CD40-CD40 ligand (CD154) interactions are strongly involved in inflammatory processes in the vessel wall leading to development of atherosclerotic disease. In this work we investigated the cyclic stretch (Flexercell Strain Unit FX-3000) induced nitration of CD40 followed by its subsequent rapid degradation in human umbilical cord venous endothelial cells (HUVEC). The stretch induced decrease in CD40 protein was prevented by inhibition of the 20S proteasome and by different scavengers of peroxynitrite. CD40 nitration also occurred under static conditions upon addition of exogenous peroxynitrite or the peroxynitrite generator SIN-1. Further investigations revealed that CD154-induced interleukin-12 p40 and E-Selectin expression significantly decreased on mRNA and protein level after brief exposure to exogenous peroxynitrite or cyclic stretch. This effect was reversed by preincubation of the cells with the peroxynitrite scavenger urate. Co-immunoprecipitation experiments revealed a decreased binding of Traf 2 and Traf 6 to CD40 after peroxynitrite treatment. Urate as well as depletion of membrane cholesterol with Methyl-β-Cyclodextrin restored CD154-mediated association of both Traf proteins with CD40. Additional Western Blot analyses showed a significant reduction in the localization of CD40 in the plasma membrane in cultured HUVEC and THP-1 monocytes following exposure to exogenous peroxynitrite. Immunofluorescence studies with THP-1 monocytes demonstrated at least a peroxynitrite-dependent redistribution of cytokine-stimulated CD40 protein from the cell membrane to the cytoplasm which was prevented by methyl-β- cyclodextrin. Through this posttranslational oxidative modification of CD40 endothelial cells may endogenously limit their capacity to interact with pro-inflammatory CD154-positive T cells or platelets, thus lowering the risk of atherosclerosis initiation and/or progression.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hämmerling, Prof. Dr. Günter J.
Date of thesis defense: 8. December 2009
Date Deposited: 12. Jan 2010 14:55
Date: 2009
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut fuer Physiologie und Pathophysiologie
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Arteriosklerose, Endothel, Antigen CD40
Uncontrolled Keywords: Tyrosinnitrierung , CD40-Funktion , Peroxynitrit , Zyklische DehnungAtherosclerosis , CD40 , tyrosine nitration , endothelial cells , peroxynitrite
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