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Role of the protein Sus1 and its interaction with the Sac3CID motif in transcription-coupled mRNA export

Klöckner, Christoph

German Title: Rolle des Proteins Sus1 und seiner Interaktion mit dem Sac3CID-Motiv in der Kopplung zwischen Transkription und mRNA Export

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Abstract

The process of gene expression in the nucleus consists of gene transcription into mRNA, posttranscriptional modification of transcripts and finally export of mRNA through the nuclear pore complex into the cytoplasm before translation into proteins can occur. Two of the protein complexes proposed to be involved in coupling of transcription and mRNA export are the SAGA complex (Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase) mediating transcription activation through histone acetylation and deubiquitination, and the TREX-2 (Sac3-Thp1-Cdc31-Sus1) complex, which interacts with the nuclear pore complex and is involved in the export of mRNA. Sac3, which is a central subunit of TREX-2, is suggested to integrate transcription and mRNA export through the CID (Cdc31-interacting domain) motif, which comprises ~80 amino acids in the C-terminal part of the protein. This motif recruits Cdc31, a calmodulin-like protein, and Sus1, a protein functioning in transcription as well as mRNA export. In addition, the CID motif is required for correct targeting of TREX-2 to nuclear pore complexes. The observation that Sac3CID acts as a crucial binding platform in TREX-2 and is also responsible for the interaction with nuclear pores makes it an attractive target to further unravel the genetic network of factors involved in transcription-coupled mRNA export. Mutants from a synthetic lethal (SL) screen with a sac3Δ allele have been analyzed for a genetic interaction with SAC3CID to identify factors that are specifically linked to transcription-coupled mRNA export. Among the SL strains that proved to be genetically interacting with SAC3CID, one strain was complemented by BUR6, the gene for a transcriptional regulator. Another strain could be complemented by SPE3, encoding the spermidine synthase. The small and basic molecule spermidine, produced by Spe3, was suggested to be involved in various nuclear processes like transcriptional repression and global chromatin organisation by interaction of spermidine with chromatin. These novel findings strengthen the connection of Sac3CID with transcriptional regulation. In addition to the search for novel genetic interactions, a complementary biochemical approach to study the link between transcription and export of mRNA was applied. Through a mutational analysis of Sus1, a factor interacting with Sac3CID inside TREX-2 as well as with the transcriptional coactivator SAGA, it was possible to identify conserved residues that are crucial for the interaction of Sus1 with its partner proteins. One of the engineered sus1 alleles showed significant loss of interaction with both SAGA and TREX-2. In contrast, two other alleles yielded highly reduced interaction with TREX-2 while interaction with SAGA remained undisturbed. Biochemical, cell biological and genetic experiments with these alleles substantiated that the binding of Sus1 to Sac3CID (and therefore TREX-2) was disrupted without affecting the interaction with the SAGA complex. A mutational analysis of the single amino acid mutations revealed their contribution to the defects of the combined alleles. These findings will help to define the selectivity and specificity of how Sus1 interacts with the complexes SAGA and TREX-2. Taken together, the results of my PhD thesis have revealed novel interactions for the genetic network of the pivotal motif SAC3CID while the creation of alleles that selectively uncouple Sus1 from TREX-2 provides the basis for a detailed analysis of the functions of the versatile protein Sus1 in transcription and mRNA export.

Translation of abstract (German)

Der Prozess der Genexpression im Zellkern besteht aus der Transkription eines Genes in mRNA, posttranskriptionellen Modifikationen der Transkripte und schließlich dem Export der mRNA durch den nukleären Porenkomplex ins Cytoplasma, bevor die Proteintranslation ablaufen kann. Zwei der Proteinkomplexe, die vermutlich an der Kopplung zwischen Transkription und Export von mRNA beteiligt sind, sind der SAGA-Komplex (Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase), der die Transkriptionsaktivierung durch Acetylierung und Deubiquitinierung von Histonen vermittelt, und der TREX-2- oder auch Sac3-Thp1-Cdc31-Sus1-Komplex, der mit der nukleären Pore interagiert und am Export von mRNA beteiligt ist. Es scheint, dass Sac3, eine zentrale Untereinheit von TREX-2, die Transkriptionsaktivierung und den Export von mRNA mittels des CID-Motivs (Cdc31-Interaktionsdomäne), welches ~80 Aminosäuren im C-terminalen Anteil des Proteins umfasst, integriert. Dieses Motiv rekrutiert Cdc31, ein dem Calmodulin ähnliches Protein, und Sus1, ein Protein mit Funktionen in der Transkription als auch im Export von mRNA. Außerdem wird das CID-Motiv für die korrekte Zielsteuerung von TREX-2 zu nukleären Porenkomplexen benötigt. Die Beobachtung, dass Sac3CID eine äußerst wichtige Bindungsfläche in TREX-2 darstellt und zusätzlich verantwortlich ist für die Interaktion mit der nukleären Pore, macht es zu einem attraktiven Ziel, um das genetische Netzwerk von Faktoren, die im Transkriptions-gekoppelten Export von mRNA involviert sind, noch weiter aufzuklären. Mutanten aus einem „synthetic lethal screen“ (SL screen) mit dem sac3Δ-Allel wurden im Hinblick auf eine genetische Interaktion mit SAC3CID untersucht, um weitere Faktoren zu identifizieren, die in einer genetischen Beziehung mit Transkriptions-gekoppeltem mRNA-Export stehen. Von den SL-Stämmen, bei denen eine genetische Beziehung mit SAC3CID gezeigt werden konnte, wurde ein Stamm durch BUR6, dem Gen für einen transkriptionellen Regulator, komplementiert. Ein anderer Stamm konnte durch SPE3, dem Gen für Spermidinsynthase, komplementiert werden. Das kleine, basische Molekül Spermidin, das von Spe3 produziert wird, wird mit verschiedenen nukleären Prozessen wie transkriptioneller Repression und globaler Organisation von Chromatin durch Interaktion mit Spermidin in Zusammenhang gebracht. Diese neuen Ergebnisse stärken die Verbindung von SAC3CID mit transkriptionellen Mechanismen. Zusätzlich zu der Suche nach neuen genetischen Interaktionen wurde ein ergänzender Ansatz verfolgt, um die Verbindung zwischen Transkription und Export von mRNA zu untersuchen. Mittels einer Mutationsanalyse von Sus1, einem Faktor, der mit Sac3CID innerhalb TREX-2 als auch mit dem Transkriptions-Koaktivator SAGA interagiert, war es möglich, konservierte Aminosäuren zu identifizieren, die wichtig für die Interaktion von Sus1 mit seinen Partnerproteinen sind. Eins der erzeugten Allele von sus1 wies einen signifikanten Verlust der Interaktion mit sowohl SAGA als auch TREX-2 auf. Im Gegensatz dazu ergaben zwei andere Allele eine stark reduzierte Interaktion mit TREX-2, während die Interaktion mit SAGA ungestört blieb. Biochemische, zellbiologische und genetische Experimente mit diesen Allelen erhärteten die Vermutung, dass die Bindung von Sus1 an Sac3CID (und dadurch an TREX-2) gestört wurde ohne die Interaktion mit dem SAGA-Komplex zu beeinflussen. Eine Mutationsanalyse der einzelnen konservierten Aminosäuren machten deren Beitrag zu den Alleldefekten deutlich. Diese Ergebnisse werden dabei helfen, die Selektivität und Spezifität der Interaktionen von Sus1 mit den Komplexen SAGA und TREX-2 zu definieren. Zusammenfassend haben die Ergebnisse meiner Dissertation neue Interaktionen im genetischen Netzwerk des zentralen Motivs SAC3CID offenbart, während die Erzeugung von Allelen, die Sus1 selektiv vom TREX-2-Komplex entkoppeln, die Basis für eine selektive Analyse der Funktionen des vielseitigen Proteins Sus1 in der Transkription und dem Export von mRNA zur Verfügung stellt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hurt, Prof. Dr. Eduard
Date of thesis defense: 5 February 2010
Date Deposited: 22 Feb 2010 08:27
Date: 2010
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Transkription [Genetik], Genexpression, RNS-Polymerase II, Messenger-RNS, Kernproteine
Uncontrolled Keywords: gene expression , mRNA export , gene expression
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