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Novel model systems for the investigation of polyvalent protein-hyaluronan interactions

Wolny, Patricia Maria

German Title: Neue Modelsysteme zur Untersuchung der polyvalenten Protein-Hyaluron-Wechselwirkungen auf der Zelloberfläche

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Abstract

The gel-like hyaluronan (HA) rich coat that surrounds many cells has been linked to a variety of vital cellular functions, but the regulatory mechanisms at the cell-HA matrix interface remain poorly understood. For the thorough investigation of specific interactions between the cell surface and HA as well as the structural properties of this supra-molecular matrix, it is desirable to switch from the complex cellular environment to simplified systems. This work aims to find routes towards the development of new in-vitro model systems of HA-rich coats. One approach relies on the immobilization of ectodomains of HA's main cell surface receptor, CD44, on supported lipid membranes (SLBs). Model surfaces with tunable receptor density are exploited to investigate the polyvalent interaction between HA and CD44 in a biologically relevant arrangement. On surfaces that provide a high density of receptors, HA binding increases in a sigmoidal fashion with molecular weight, and becomes reversible below 30 kDa. The physico-chemical properties of these HA films reveal many similarities between the binding behavior of HA chains and flexible polymer chains adsorbing to a homogeneously attractive surface. On surfaces with low receptor surface density binding of HA of sufficiently high molecular weight is irreversible for all, and proportional to the amount of receptors. Quantifying the number of receptors that are available per HA chain provides insight how polyvalent interactions stabilize HA binding on receptor covered surfaces. HA binding is though regulated by both polyvalency and the intrinsic affinity of individual receptors, and we outline a method to disentangle the contributions of both effects. Another approach envisages the immobilization of HA via a terminal biotin moiety at controlled anchor separation. The binding and activity of biotin-receptors on gold and silica is systematically examined with the objective to selectively functionalize gold nanostructured surfaces. We find that streptavidin adsorbs in a functional conformation on gold while resisting binding to silica. First attempts to exploit this selectivity on gold nanostructures are presented. The confinement of the model systems to solid supports enables qualitative and quantitative characterization by complementary surface sensitive techniques. Here, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring and ellipsometry - alone or in combination - as well as microinterferometry provide detailed insight into the formation, stability and morphology of the model surfaces and the HA films, and involved molecular interactions. The developed model systems with tunable properties can serve as a well-controlled experimental platform for the investigation of the interactions between proteins and HA in a supra-molecular context, and between cells and HA-matrices.

Translation of abstract (German)

Viele Zellen umgeben sich mit einer gelartigen Hülle aus Hyaluron (HA). Solche Hyaluron- Hüllen spielen eine wichtige Rolle bei einer Reihe essentieller Zellfunktionen. Die Mechanismen, welche die Interaktion im speziellen and der Grenzfläche zwischen HA und Zelle regulieren, sind jedoch nur mangelhaft erforscht. Für ein eingehendes Studium der spezifischen Wechselwirkung zwischen der Zelloberfläche und HA sowie der strukturellen Eigenschaften dieser supramolekularen Matrix, erscheint es sinnvoll, weg von der Komplexität der Zelle zu einem vereinfachten System zu gehen. Es war daher das Ziel dieser Doktorarbeit, Wege zur Entwicklung neuer in-vitro-Modelsysteme der HA-Matrix zu finden. Einer der Ansätze bedient sich der Immobilisierung von Ectodomänen des primären Zelloberflächenrezeptors für HA, CD44, auf substratgebundenen Modelmembranen (SLBs). Solche Modeloberflächen, deren Dichte an Oberflächenrezeptoren kontrolliert eingestellt werden kann, werden benutzt, um polyvalente Wechselwirkungen zwischen HA und CD44 in einer biologisch relevanten Umgebung und Anordnung zu untersuchen. Auf Oberflächen mit hoher Rezeptorbedeckung ist die Bindung von HA mit geringem Molekurlargewicht (unter 30 kDa) reversibel und nimmt sigmoidal mit dem Molekulargewicht der HA-Kette zu. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser HA-Filme zeigen viele Parallelen zum Adsorptionsverhalten von flexiblen Polymerketten an eine homogen attraktive Oberfläche. Auf der anderen Seite, ist die Bindung von HA - gegeben das Molekulargewicht ist ausreichen - auch bei geringen Rezeptordichten irreversibel und proportional zur Menge der Rezeptoren. Bestimmt man quantitativ die Anzahl der Rezeptoren, die jeder HA-Kette zur Verfügung stehen, wird deutlich, dass polyvalente Wechselwirkungen die Bindung von HA an die oberflächengebundenen Rezeptoren stabilisieren. Die Regulierung der Bindung von HA unterliegt jedoch sowohl Polyvalenzeffekten als auch der intrinsischen Affinität der individuellen Rezeptoren, und wir leiten hier eine Methode ab, mit der sich die Beiträge beider Effekte voneinander abgrenzen lassen. In einem weiteren Ansatz soll HA über eine terminale Biotin-Einheit in kontrollierten Abständen auf einer Oberfläche immobilisiert werden. Mit dem Ziel, gold-nanostrukturierte Oberflächen selektiv zu diesem Zweck zu funktionalisieren, werden die Bindung und Aktivität verschiedener biotin-bindender Proteine an Gold und Siliziumoxid-Oberflächen systematisch untersucht. Es stellt sich heraus, dass Streptavidin die besondere Eingenschaft hat, in aktiver Form auf Goldoberflächen zu adsorbieren, während es keinerlei Interaktion mit der Siliziumoxid-Oberfläche eingeht. Wir zeigen, wie diese Selektivität in ersten Versuchen zur Funktionalisierung der nanostrukturierten Oberflächen ausgenutzt werden kann. Alle vorgestellten Modelsysteme basieren auf festen Substraten, eine Eigenschaft, die die qualitative und quantitative Charakterisierung mit Hilfe komplementärer, oberflächensensitiver Untersuchungsmethoden ermöglicht. Die Verwendung der Quartz- Kristall-Mikrowage mit Dissipationskontrolle (QCM-D) und Ellipsometrie - einzeln oder in einem kombinierten Aufbau - sowie Mikrointerferometrie erlauben detailierte Einsichten in die Bildung, Stabilität und Morphologie der Modeloberflächen, der HA-Filme und der damit einhergehenden molekularen Wechselwirkungen. Die hier entwickelten Modelsysteme, die sich dadurch auszeichnen, dass sie gezielt eingestellt und kontrolliert manipuliert werden können, eignen sich als gut charakterisierte experimentelle Plattformen zur Untersuchung der spezifischen supramolekularen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und HA. Sie können des Weiteren interessante Anwendungen bei Studien der Interaktion zwischen Zellen und den HA-Filmen finden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim
Date of thesis defense: 2. March 2010
Date Deposited: 19. Mar 2010 07:32
Date: 2010
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: Biophysik , funktionalisierte Oberfächen , nanostrukturierte Oberflächen , Hyaluron , Polyvalente Wechselwirkungenbiophysics , surface bio-functionalization , nanostrctured surfaces , hyaluronan-rich films , polyvalent interactions
Additional Information: Teile in: Langmuir 2010, 26(2), pp 1029-1034
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