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Entwicklung stabiler Gold Nanopartikel-Peptid-Konjugate zur Untersuchung von Rezeptor-Liganden Wechselwirkungen im zellulären System

Maus, Lisa

English Title: Design of Stable Gold Nanoparticle-Peptide-Conjugates to Study Receptor-Ligand Interactions in the Cellular System

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PDF, German
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Abstract

In dieser Arbeit wird eine neuartige Syntheseroute zur Herstellung biokompatibler und hochstabiler Gold Nanopartikel-Peptid-Konjugate entwickelt, die der gezielten Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen in hippocampalen Neuronen dienen. Aktivierte NMDA-(N-Methyl-D-Aspartat) Rezeptoren vermitteln vermutlich abhängig von ihrer räumlichen Lage in der postsynaptischen Zelle verschiedene Signalkaskaden: Die Aktivierung synaptischer NMDA-Rezeptoren fördert das Überleben der Zelle, während die Aktivierung der extrasynaptischen Rezeptoren zum programmierten Zelltod führt. Um diese Hypothese der positionsabhängigen Funktion der unterschiedlich lokalisierten NMDA-Rezeptoren zu untersuchen, werden Nanopartikel entwickelt, die aufgrund ihrer Ausdehnung nicht in den synaptischen Spalt diffundieren können. Werden diese Nanopartikel mit einem selektiven NMDA-Rezeptorantagonisten funktionalisiert, sollten ausschließlich die extrasynaptischen NMDA-Rezeptoren blockiert werden ohne die synaptischen NMDA-Rezeptoren zu erreichen. Zunächst wird daher in dieser Arbeit die gezielte Darstellung von Gold Nanopartikeln mit einem vorher bestimmbaren Durchmesser ( größer 30 nm) optimiert, die zudem eine geringe Größenverteilung besitzen. Um die synthetisierten Nanopartikel vor Aggregation zu schützen, werden sie mit einer gemischten Monolage aus Amino- und Carbonsäure terminierten thiolierten Polyethylenglykol (PEG)-Liganden versehen. Diese stabilisieren die Partikel einerseits aufgrund sterischer und elektrostatischer Effekte der Carbonsäure, während die Aminogruppen der weiteren Biofunktionalisierung dienen. Das synthetisierte Alkyl-PEG 600 System wird hierzu mit dem kommerziell erhältlichen PEG 3000 System verglichen. Die resultierenden Nanopartikel beider Systeme besitzen eine hohe Stabilität bezüglich Aggregation in hochkonzentrierten Salzlösungen sowie Zellkulturmedium. Neben der Charakterisierung der Schichtdicke der Polymere werden die Nanopartikel auf ihre chemische Zusammensetzung der Passivierungsschicht untersucht. Hierzu dient ein in der vorliegenden Arbeit entwickeltes, neuartiges fluoreszenz-basiertes Verfahren. Die Anzahl reaktiver Aminogruppen auf der Oberfläche kann so quantitativ bestimmt werden, wodurch die Desorption der thiolierten Liganden mit der Zeit von der Goldoberfläche beobachtet wird. Weiterhin wird gezeigt, dass die Anzahl der gebundenen Aminogruppen beeinflusst und kontrolliert werden kann. In einem analogen fluoreszenz-basierten Verfahren wird die durchschnittliche Anzahl an bioaktiven Peptiden pro Partikel bestimmt - eine wichtige Information zur Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen im Hinblick auf multivalente Liganden. Das Verfahren zeigt erstmals, dass das Alkyl-PEG 600 System eine direkte Bindung der Peptide an die Oberfläche der Partikel unterbindet, während im kommerziellen PEG 3000 System eine solche unerwünschte direkte Bindung nicht verhindert werden kann. Damit ist das Alkyl-PEG 600 System für die kontrollierte und definierte Darstellung von Peptid-Nanopartikel-Konjugaten besser geeignet, als das kommerziell erhältliche PEG3000 System. Zur Untersuchung der Wechselwirkung der Peptid-funktionalisierten Nanopartikel mit NMDARezeptoren wird ein Modellsystem eingesetzt, in welchem HEK 293 Zellen transient mit Plasmiden der NMDA-Rezeptoruntereinheiten transfiziert werden. In diesen Zellexperimenten kann die spezifische Wechselwirkung der Peptid-funktionalisierten Gold Nanopartikel sowohl qualitativ mittels elektronenmikroskopischen Aufnahmen, als auch quantitativ in einer Bindungsstudie nachgewiesen werden. Zudem wird die Bindungskonstante der Konjugate bestimmt, die um einen Faktor 1000 größer ist, als die des löslichen Antagonisten. Damit wird bestätigt, dass die hergestellten biofunktionalisierten Nanopartikel für die Anwendung im biologischen System bestens geeignet sind.

Translation of abstract (English)

The goal of this thesis is the design of stable and biocompatible gold nanoparticles functionalized with active peptides to enable the study of cell death pathways in primary hippocampal neurons. Activated NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptors are thought to trigger different signalling pathways that are dependent on the receptor location within the postsynaptic cell: Synaptic NMDA receptors play an important role in cell survival processes whereas extrasynaptic NMDA receptors are thought to promote cell death pathways. In order to prove this hypothesis of differential signalling, a special antagonist for extrasynaptic NMDA receptors has to be designed. Gold nanoparticles are therefore synthesized which are excluded from the synaptic cleft due to their size. If these particles are functionalized with a selective NMDA receptor antagonist, these particles should allow exclusive blockage of extrasynaptic NMDA receptors thereby blocking cell death pathwasys leaving synaptic receptors unaffected.Initially, the synthesis of large (larger 30 nm) gold nanoparticles is optimized which allows the preparation of monodisperse, spherical particles with a predefined size. In order to prevent aggregation of the nanoparticles, the obtained particles are passivated with a mixed monolayer composed of amino and carboxylic acid terminated thiolated poly(ethylene) glycol (PEG) derivatives. The carboxylic acid groups essentially stabilize the particles due to electrostatic repulsion, whereas the amino groups allow for further functionalization. Here, the commercially available PEG 3000 passivation system is compared to a synthesized Alkyl-PEG 600 system. Both ligands prevent aggregation of the particles in high ionic strength solutions up to a salt concentration of 2 M NaCl. Furthermore, these passivated particles show an increased stability in cell culture medium for at least 24 hours compared to non-passivated particles which immediately aggregate upon addition of cell culture medium. The size of the resulting particles including the polymer coat, as well as the chemical composition of the passivation layer is characterized. The latter is achieved by the development of a novel quantitative fluorescencebased assay to analyze the number of reactive amino groups in the passivation shell. Time dependent analysis of the passivated particles indicates desorption of the thiol-bearing passivation ligands over time. Moreover, it is shown that the amount of reactive amino groups in the ligand shell can be defined and controlled. Similar to this fluorescence-based assay it is shown herein that the average number of conjugated bioactive peptides can be analyzed and tuned accordingly. The average number of bioactive peptides per particle is indeed of importance for exploring the influence of multivalent ligands. Interestingly, the Alkyl-PEG 600 passivation system prevents the direct binding of the thiol containing peptide, whereas the incubation of peptides with PEG 3000 passivated particles leads to a detectable amount of peptides bound directly to the nanoparticle core. The PEG 3000 passivation system is therefore not equally suited for the controlled and defined functionalisation of gold nanoparticles. In order to study the bio-applicability of the peptide functionalized particles designed in this thesis, as well as to evaluate the activity of the prepared conjugates, we utilized a model system of HEK 293 cells which are transiently transfected with NMDA receptor subunits. We clearly observe significantly higher binding of the particles to the transfected cells compared to all control experiments. Additionally, the binding constant of these conjugates is determined to be significantly higher than the binding constant of the soluble peptides. These results clearly demonstrate that the engineered system of peptide-functionalized nanoparticles is well suited to study receptor-ligand interactions in hippocampal neurons.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim P.
Date of thesis defense: 23. April 2010
Date Deposited: 27. May 2010 09:18
Date: 2010
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Nanopartikel
Uncontrolled Keywords: Conantokin G , Synaptischer Spalt , NMDA Rezeptor , fluoreszenzbasierte quantitative Bestimmungconantokin G , synaptic cleft , NMDA receptor , fluorescence based quantitative assay
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