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Molecular Studies on Dengue Virus-Host Interaction

Victoria Ansalem, Anil Kumar

German Title: Molecular Studies on Dengue Virus-Host Interaction

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Abstract

Dengue is the most prevalent mosquito-borne viral disease world-wide. The causative agent Dengue Virus (DENV) is a positive strand RNA virus replicating predominantly in monocyte-derived macrophages and dendritic cells. The severi-ty of the disease is strongly linked to the level of viral replication, which is de-termined, amongst others by pre-existing DENV-specific antibodies and genetic determinants of the virus and the host. The aim of my thesis was to characterize the role of nonstructural protein 5 (NS5) for the DENV replication cycle. NS5 is a multifunctional protein involved in viral RNA replication, 5’ end capping and blocking of interferon (IFN)-mediated signaling by degrading STAT2. Although DENV replicates in the cytoplasm, NS5 mostly accumulates in the nucleus of infected cells. This study investigated the determinants of NS5 nuclear transport and the effects of nuclear NS5 on viral replication and innate immunity. Nuclear accumulation of NS5 occurred inde-pendent from other viral proteins and was found in infected mammalian and mosquito cells arguing for an evolutionarily conserved property. A mutation analysis was used to identify amino acid residues in NS5 essential for nuclear accumulation. Replication analyses of these nuclear localization signal (NLS) mu-tants showed that even though a high level of nuclear NS5 is not required for efficient DENV replication, complete abrogation of nuclear transport significantly reduced viral replication. Interestingly, the poorly replicating NLS mutants could not be rescued by providing wild type protein in trans indicating that factors other than nuclear NS5 are responsible for their poor replication. To check whether these NLS mutations affect enzymatic activities of NS5, recombinant full length proteins were bacterially expressed and purified. Enzymatic assays showed that save for one, none of the NLS mutations impaired RNA-dependent RNA polymerase or methyl transferase activity. Moreover, IFN sensitivity of the NLS mutants was similar to wild type indicating that nuclear NS5 is not required to counteract IFN induced genes. Contrary to earlier observations no significant difference was observed in induction of interleukin-8 by wild type and mutant NS5. In the second part of my PhD study, I performed a genome-wide RNAi-based kinase screen to identify cellular kinases promoting or restricting DENV replication. An imaging based RNAi screening platform for DENV was developed, which included optimization of siRNA-mediated silencing in human hepatoma cells, viral infection, immunostaining, image acquisition and statistical data analysis. The primary screen was carried out with a kinase library targeting all known and putative cellular kinases with three siRNAs per gene. Approximately 100 kinases selected from the primary screen were validated in an infection based screen with a new siRNA library containing a different set of siRNAs against each gene. The screen identified 18 kinases essential for DENV replication and 15 kinases suppressing viral replication. The kinase siRNAs were later tested in a DENV subgenomic reporter replicon based screen to differentiate their role in viral en-try or replication. The effect of selected kinases on DENV infection was further validated using chemical inhibitors. The kinases identified by this study can serve as targets for developing novel antiviral compounds against dengue infection.

Translation of abstract (German)

Das Denguefieber ist die am häufigsten von Stechmücken übertragene Viruskrankheit weltweit. Ursache für die Infektionskrankheit ist das Dengue Virus (DENV), ein einzelsträngiges RNA Virus, welches vorwiegend in von Monocyten abstammenden Makrophagen und dendritischen Zellen repliziert. Die Schwere des Krankheitsverlaufs ist abhängig von der Stärke der viralen Replikation, welche u. a. von bereits vorhandenen DENV-spezifischen Antikörpern und genetischen Determinanten des Virus und des Wirts abhängt. Das Ziel meiner Arbeit ist die Charakterisierung der Funktion des Nicht-Struktur Proteins 5 (NS5) im Replikationszyklus des DENV. NS5 ist ein multifunktionelles Protein, welches in die Replikation der viralen RNA, der Erstellung der 5’-Cap-Struktur sowie der Blockierung Interferon (IFN)-induzierter Signalwege durch Degradation von STAT2 involviert ist. Obwohl DENV im Zytoplasma repliziert, akkumuliert das Protein hauptsächlich in den Nuklei infizierter Zellen. Im Laufe dieser Arbeit wurden die Determinanten für den Transport von NS5 in den Nukleus sowie den Einfluss des nukleären NS5 auf virale Replikation und die angeborene Immunabwehr untersucht. Die Akkumulierung von NS5 im Nukleus erfolgte unabhängig von den anderen DENV Proteinen und konnte sowohl in infizierten Säuger- als auch Stechmückenzellen gezeigt werden, was für eine evolutionär konservierte Eigenschaft des viralen Proteins spricht. Um Aminosäuren zu identifizieren, die für die nukleäre Akkumulation von NS5 essentiell sind, wurden Mutationsanalysen durchgeführt. Analysen der Replikation von Viren mit Mutationen im nukleären Lokalisationssignal (NLS) von NS5 zeigten, dass ein hoher Grad an NS5-Akkumulation im Kern für effiziente Replikation nicht nötig ist. Ist jedoch der nukleäre Transport des Proteins komplett blockiert, führt dies zu einer signifikanten Reduktion der viralen Replikation. Interessanterweise konnte die reduzierte Replikation der NLS-Mutanten nicht durch in trans-Komplementierung von Wildtyp-NS5 wiederhergestellt werden. Dies spricht dafür, dass zusätzlich zur Kernlokalisation weitere Eigenschaften des Proteins für die geringe Replikation verantwortlich sind. Um zu überprüfen, ob Mutationen im NLS von NS5 Auswirkungen auf dessen enzymatische Aktivität haben, wurden rekombinante Volllänge-Proteine mittels eines bakteriellen Expressionssystems hergestellt und aufgereinigt. Enzymatische Analysen zeigten, dass mit Ausnahme einer Mutante keine der Mutationen die RNA-abhängige RNA-Polymerase- oder die Methyl Transferase Aktivität beeinflusst. Außerdem war die IFN-Sensitivität der NLS-Mutanten vergleichbar mit der des Wildtyps, was dafür spricht, dass NS5 nicht notwendig ist, um IFN-indizierten Genen entgegenzuwirken. Im Gegensatz zu früheren Beobachtungen konnte kein signifikanter Unterschied in der Induktion von Interleukin-8 durch das Wildtyp- oder das mutierte NS5 festgestellt werden. Im zweiten Teil meiner Arbeit führte ich einen genomweiten, RNAi-basierten Hochdruchsatz-Suchtest durch, um zelluläre Kinasen zu identifizieren, die die DENV Replikation unterstützen oder einschränken. Die Etablierungsphase beinhaltete das Erstellen von Versuchsprotokollen für einen bildbasierten Suchtest, was die Optimierung der Genexpressionshemmung in humanen Hepatomzellen, virale Infektion, Immunmarkierung infizierter Zellen, Bildaufnahme sowie die statistische Auswertung der Ergebnisse beinhaltete. Der primäre Suchtest adressierte alle bekannten und mutmaßlichen zellulären Kinasen mit je drei siRNAs pro Gen. Ungefähr 100 Kinasen wurden aufgrund des primären Suchtests in einem infektions-basierten Validierungs-Suchtest mit je drei weiteren unabhängigen siRNAs pro Gen untersucht. Der Suchtest identifizierte 18 Kinasen, die die DENV Replikation unterstützen und 15 Kinasen, die die virale Replikation einschränken. In einer weiteren Analyse mit einem subgenomischen Reporter Replikon wurde anschließend getestet, ob die Kinasen eine Rolle im Zelleintritt oder der RNA Replikation des Virus spielen. Der Effekt einzelner ausgewählter Kinasen auf das Virus wurde außerdem durch den Einsatz von chemischen Inhibitoren validiert. Die Kinasen, die in dieser Arbeit identifiziert wurden, können zur Entwicklung neuer antiviraler Wirkstoffe gegen das Denguefieber führen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bartenschlager, Prof. Dr. Ralf
Date of thesis defense: 16 June 2010
Date Deposited: 24 Jun 2010 09:08
Date: 2010
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Dekanat der Medizinischen Fakultät Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Dengue Virus, Kinome siRNA screen, Nuclear Transport, Nicht-Struktur Proteins 5, NS5
Uncontrolled Keywords: Dengue Virus , Kinome siRNA screen , Nuclear Transport , Non-structural protein 5 , NS5
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