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Drosophila myogenesis as a model for studying cis-regulatory networks : identifying novel players and dissecting the role of transcriptional repression

Ciglar, Lucia

German Title: Drosophila Muskelentwicklung als Modelsystem für Netzwerke der Genregulation : Identifikation neuer Faktoren und die Rolle der Genrepression

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Abstract

Recent studies have identified in vivo binding profiles of key mesodermal regulators across the Drosophila melanogaster genome. Many of the occupied sites lie in the vicinity of loci encoding yet other transcription factors. The analyzed cis- regulatory modules drive expression in a variety of complex spatio-temporal patterns that cannot be explained by the binding of the core regulators alone. Thus there clearly are additional, unknown transcription factors in the regulatory network that governs the process of embryonic mesoderm specification and muscle differentiation. In order to identify novel myogenic regulators in a systematic way, and thereby enrich the underlying network, I initiated a molecular screen to uncover new players. Candidate putative transcription factors were prioritized based on their expression in mesoderm and on available ChIP-on-chip and expression profiling data. Their role in myogenesis was subsequently assayed using Drosophila deficiency lines whose phenotypes were analyzed with a muscle-specific marker. Altogether, 67 different deficiency and loss-of-function lines were used individually or in combination to delete 46 transcription factors with mesodermal expression. In 21 of the 46 cases, the mutant embryos displayed specific defects in the development of one or more muscle types. One pair of partially overlapping deficiencies placed in trans showed a failure in myoblast fusion, a process that gives rise to muscle syncytia from mononucleated myoblasts. The corresponding deleted candidate gene was MED24, a subunit of the Mediator complex, which is a general co-activator of transcription. Muscle-specific knockdown of MED24 or MED14, another subunit of the complex whose deletion by deficiency lines phenocopies that of MED24, leads to lethality. To establish whether MED24 and MED14 are indeed involved in muscle development, I generated smaller deletion lines using FRT-mediated recombination. While deletion of MED14 does not affect myogenesis, embryos deficient for MED24 display supernumerary mononucleated myoblasts. Both small deletion lines were then combined together to detect possible redundancy that could obscure the requirement of MED14 and MED24 in muscle development. Another candidate transcription factor within the myogenic network based on ChIP-on-chip experiments is the transcriptional repressor Tramtrack69 (Ttk69). Ttk69 is expressed in the primordium of visceral and, more transiently, somatic muscle. In ttk69 mutant embryos, homozygous for a loss-of-function allele, myoblast fusion is delayed, the myoblasts aggregate in clusters, and fail to migrate towards the ectodermal attachment sites. Two distinct myoblast populations, a founder cell and multiple fusion competent myoblasts, contribute to each muscle fibre. As revealed by immunohistochemistry and in situ hybridization, in ttk69 mutants there are significantly more founder cells formed while the number of fusion competent myoblasts is decreased. Consistently, ectopic expression of Ttk69 in the founder cells, but not fusion competent myoblasts, gives rise to severe myoblast fusion defects. These phenotypic analyses suggest a model where Ttk69 is required for specification of fusion competent myoblasts and in its absence, their conversion to a founder cell-like fate may occur. According to the proposed model, Ttk69 would repress founder cell genes within the fusion competent myoblasts. To determine whether this holds true on a global scale, I performed a high-resolution ChIP-on-chip experiment in 6-8 hour wild type embryos. Indeed, Ttk69 binding was significantly enriched in the vicinity of founder cell-specific genes as compared to fusion competent myoblast-specific genes. ChIP-on-chip data generated for Lame duck, a transcriptional activator essential for fusion competent myoblast determination, showed the opposite tendency. It therefore appears that proper specification of fusion competent myoblast identity requires both positive input from Lame duck and inhibition of founder cell-specific genes by Ttk69. These findings advance our limited knowledge about the role of transcriptional repression within the myogenic regulatory network. Finally, I re-evaluated the role of Snail, a well-established transcriptional repressor involved in early mesoderm specification and gastrulation. Multiple observations suggested that Snail may also play a positive role in regulating mesodermal genes. To investigate this possibility, I performed luciferase assays with previously characterized mesodermal enhancers and showed that Snail can elevate their activation levels. In one case, this ability of Snail was suppressed upon mutagenesis of putative Snail binding motifs, both in cell culture and in vivo. Moreover, expression of the enhancers and their associated genes is significantly reduced in snail mutant embryos. Snail thus seems to play a dual role in repressing non-mesodermal genes, but also in contributing to the activation of some early mesodermal genes.

Translation of abstract (German)

Jüngste Studien haben die in-vivo Bindungsprofile der bedeutendsten mesodermalen Transkriptionsfaktoren genomweit in Drosophila melanogaster identifiziert. Viele dieser Bindungsstellen befinden sich in direkter Nähe weiterer Transkriptionsfaktoren. Die analysierten cis-regulativen Module (CRMs) werden in verschiedenen räumlichen und zeitlichen Mustern exprimiert. Diese komplexen Muster können mit der Aktivität der wenigen Schlüsselfaktoren nicht erklärt werden. Es muss daher weitere, bislang unbekannte Transkriptionsfaktoren geben, die Genregulation bei der embryonalen Mesodermspezifizierung und Muskeldifferenzierung beeinflussen. Um systematisch neue Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, und somit das genetische Netzwerk der Muskelentwicklung zu erweitern, startete ich einen molekulare Analyse. Potenzielle Transkriptionsfaktoren wurden anhand mehrerer Kriterien, wie z.B. ihrer mesodermalen Exprimation und ihrer möglichen Regulation durch besagte Schlüßelfaktoren, bevorzugt. Deren Wichtigkeit für die Myogenese wurde anhand von Defizienz- und ’Loss-of-function’ Mutanten studiert. Insgesamt wurden 67 solcher Mutanten benutzt um 46 Transkriptionsfaktoren zu untersuchen. In 21 von 46 Fällen konnte ich bestimmte abnorme Phänotypen in der Embryonalmuskulatur beobachten. In einem besonders interessanten Fall kann man mit sich teilweise überschneidenden Defizienzmutanten einen klaren Myoblastfusionsdefekt beobachten. Interessanterweise ist das hier fehlende Gen Med24, welches ein Bestandteil des Mediator Komplexes ist. Da der Mediator Komplex ein genereller Co- Activator der Genexprimation ist, bestand hier die Möglichkeit, dass es sich in Med24 um eine gewebe-spezifische Komponente des Mediator Komplexes handelt. Auch Med14 könnte eine muskelspezifische Rolle im Mediator Komplex spielen. Ein muskelspezifischer ’knock-down’ von Med24 als auch Med14 ist früh in der Embryonalentwicklung letal. Um die Rolle beider Faktoren in der Muskelentwicklung näher zu untersuchen habe ich durch FRT-Rekombination wesentlich kleinere, zielgerichtete Segmente entfernt. Während Verlust von Med14 nicht zu Myogenesedefekten führt, zeigen Med24-defiziente Embryonen eine hohe Anzahl von mononuklearen Myoblasten auf. Ein weiterer Transkriptionsfaktorkandidat der Drosophila Muskelentwicklung ist der Repressor Tramtrack69 (Ttk69). Ttk69 wird in den Anlagen der Viszeral- und, weniger stark und weniger dauerhaft, auch in der Skelettmuskulatur exprimiert. In ttk69 Mutanten, ist die Fusion der Myoblasten verzögert – Myoblasten aggregieren und migrieren scheinbar nicht zu ihren respektiven ektodermalen Ansatzstellen (attachment sites). Zwei bestimmte Zelltypen, Gründer Zellen (founder cells, FCs) und Fusions-kompetente Myoblasten (fusion competent myoblasts, FCMs), tragen zu jeder Muskelfibrille bei. Sowohl Immunohistochemie, als auch in- situ Hybridisierung zeigen, dass ttk69 Mutanten wesentlich mehr FCs aufweisen, während die Zahl der FCMs geringer ist. Embryonen die gezwungen werden Ttk69 in FCs, nicht aber in FCMs zu exprimieren, sterben meist ab. Dies könnte darauf hindeuten, dass Ttk69 für die Spezifizierung von FCMs nötig ist, und das diese Zellen in der Abwesenheit von Ttk69 dazu neigen sich als FCs heranzubilden Es ist daher möglich, dass Ttk69 dazu dient die Exprimation von FC-Genen in den FCMs zu unterdrücken. Um diese Möglichkeit näher zu untersuchen, habe ich eine ChIP-on-chip Studie an 6-8 Std. Wildtyp-Embryonen durchgeführt. In der Tat, Ttk69 konnte insbesondere in der Nähe von FC-spezifischen Genen gefunden werden. Interessanterweise zeigen ChIP-on-chip Studien mit Lame Duck, einem Aktivator wichtig für FCM Identität, den gegengesetzten Phänotyp auf – Lame Duck ist vor allem in der Nähe von FCM Genen zu finden. Es scheint daher, dass zur Spezifizierung der FCMs sowohl Genaktivierung durch Lame Duck, als auch negative Regulation von FC Genen durch Ttk69 nötig ist. Diese Resultate erweitern unser sehr limitiertes Verständnis der Rolle der Genrepression innerhalb des Drosophila Muskelnetzwerks. Schließlich habe ich auch die Rolle des Repressorproteins Snail näher untersucht. Snail ist vor allem für die Etablierung der naïven Mesodermanlage und für den Ansatz der Gastrulation wichtig. Einige Observationen legen es nahe, daß Snail einige Gene auch positiv regulieren könnte. Um dies näher zu erschließen habe ich Luciferase Studien durchgeführt. Tatsächlich ist es der Fall, das einige CRMs durch Zusatz von Snail in ihrer Aktivität steigen. Insbesondere in einem Fall konnte ich zeigen, das die gesteigerte CRM Aktivität auch tatsächlich von den Snail Bindungsstellen abhängt, sowohl in Zellkultur, als auch in vivo. Zusätzlich ist auch noch die in vivo Aktivität einiger CRMs in Snail Mutanten gemindert. Daher scheint Snail tatsächlich eine Doppelrolle zu spielen, indem es viele nicht-mesodermale Gene in der Mesodermanlage unterdrückt, andere mesoderm-spezifische Gene aber aktiviert.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Steinbeisser, Prof. Dr. Herbert
Date of thesis defense: 6 July 2010
Date Deposited: 08 Jul 2010 09:54
Date: 2010
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Drosophila , muscle , development , transcription regulation
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