English Title: Regulation of human T cell activation under conditions of arginine depletion

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Abstract

Die Verstoffwechslung der semiessentiellen Aminosäure Arginin ist entscheidend beteiligt an der Regulation der Immunantwort im Verlauf von Infektionen, entzündlichen Erkrankungen und bei Tumorwachstum. Arginin wird durch die Enzyme Arginase und Stickstoffmonoxid-Synthase abgebaut, wodurch die Verfügbarkeit der Aminosäure reguliert wird. Eine lokale Arginindepletion, welche z.B. durch Freisetzung von Arginase 1 aus myeloischen Zellen verursacht wird, führt zur völligen Hemmung der Proliferation und zahlreicher Effektor-Funktionen aktivierter humaner T-Lymphozyten. Hierbei waren die intrazellulären Mechanismen, welche zur Suppression zahlreicher T-Zell-Funktionen bei Argininmangel führen, bei Beginn dieser Promotionsarbeit, weitgehend unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Argininmangel auf die intrazelluläre Signaltransduktion in aktivierten primären humanen T-Zellen gesunder Blutspender in vitro untersucht. Durch proteomische Analysen konnte gezeigt werden, dass das Fehlen der Aminosäure Arginin bei T-Zell-Aktivierung zu einer signifikant reduzierten Dephoshorylierung des Aktin-bindenden Proteins Cofilin führt. Normalerweise führt die Stimulation über den T-Zell-Rezeptor und kostimulatorische Moleküle via Dephosphorylierung zur Aktivierung von Cofilin, welches eine entscheidende Rolle bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts, der T-Zellproliferation und Zytokinsekretion spielt. Im Zusammenhang mit der Persistenz der phosphorylierten Form von Cofilin zeigte sich bei Argininabwesenheit ein veränderter F-Aktingehalt in aktivierten T-Zellen. Außerdem korrelierte die verminderte Ausbildung der Immunologischen Synapse, der Kontaktzone zwischen T-Zelle und antigenpräsentierende Zelle, mit der fehlenden Aktin-Bindefähigkeit von Cofilin. Im Gegensatz dazu ist ein weiterer Cofilin-abhängiger Prozess, die Migration, bei Argininabwesenheit unbeeinträchtigt. Ferner konnte erstmals eine dichotome Regulation der Zytokinsynthese und -sekretion in humanen T-Lymphozyten bei Arginindefizienz gezeigt werden. Während Arginindepletion zu einer signifikanten Inhibition von Produktion und Sekretion der Zytokine IFN-g, TNF-b und IL-10 führt, zeigte sich eine unbeeinträchtigte Synthese der Zytokine IL-2, IL-6 und IL-8. Weitere Untersuchungen zur frühen (1-30 min) Signaltransduktion bei T-Zell-Aktivierung zeigten, dass der Kalziumflux unabhängig von der extrazellulären Argininkonzentration induziert wird. Auch fanden sich keine argininabhängigen Unterschiede in der frühen Cofilin-Dephosphorylierung sowie bei Aktivierung der für die Cofilin-Dephosphorylierung verantwortlichen Ras-MEK-ERK- und Ras-PI3K-Akt-Signalwege. Im weiteren Verlauf zeigte sich dann bei Argininmangel in Assoziation mit der beeinträchtigten Cofilin- Dephosphorylierung eine reduzierte ERK-Phosphorylierung bei prolongierter Akt-Phosphorylierung. Diese Alterationen der T-Zell-Signaltransduktion fanden sich gleichartig auch bei Stimulation der Zellen in einem durch humane Granulozyten-Arginase (aus humanem Eiter ex vivo gewonnen) von Arginin depletierten Milieu und waren durch Zugabe eines Arginase-Inhibitors vollständig inhibierbar. Dieses Modell unterstreicht die Relevanz der beschriebenen T-Zell-Alterationen für die Situation granulozytär dominierter Inflammation in vivo. Das durch diese Arbeit gewonnene, bessere Verständnis intrazellulärer Regulationsmechanismen humaner T-Lymphozyten bei Arginindefizienz sollte dazu beitragen, in Zukunft in die unerwünschte Immunsuppression bei Tumorerkrankungen oder chronischer Inflammation kausal pharmakologisch eingreifen zu können.

Translation of abstract (English)

Metabolism of the semi-essential amino acid arginine is fundamentally involved in regulation of the immune response during infection, inflammatory diseases and tumour growth. The availability of arginine is regulated by the enzymes arginase and nitric oxide synthase. Local arginine depletion, e.g. mediated through the release of arginase 1 by myeloid cells, results in the total suppression of proliferation and inhibition of several effector functions of activated human T-lymphocytes. The intracellular mechanisms leading to the observed suppression of T-cell functions under conditions of arginine depletion were largely uncharacterised at the start of this thesis. In this thesis, the effect of arginine depletion on intracellular signal transduction pathways in activated T cells of healthy human blood donors was investigated. Proteomic analysis revealed that the absence of the amino acid arginine during T cell activation leads to a significant reduction in dephosphorylation of the actin-binding protein cofilin. Cofilin is an essential component in reorganisation of the actin cytoskeleton, T cell proliferation and cytokine secretion and is activated through dephosphorylation upon stimulation of the T cell receptor and co stimulatory molecules. Persistence of the phosphorylated form of cofilin in the absence of arginine results in altered F-actin concentration in activated T cells. Furthermore, a disturbed formation of the immunological synapse, the contact area between T cells and antigen presenting cells, correlates with the missing actin binding capacity of cofilin. In contrast, chemotactic migration (another cofilin-dependent process), is unaltered in the absence of arginine. In addition, dichotomic regulation of cytokine synthesis and secretion in human T cells upon arginine depletion was demonstrated for the first time. While arginine depletion leads to significant inhibition in the production and secretion of IFN-g, TNF-ß and IL-10, the synthesis of IL-2, IL-6 and IL-8 is unimpaired. Furthermore, it was shown that the induction of calcium flux during early signal transduction (1-30 min) in activated T cells is independent of the extracellular arginine concentration. Also, cofilin-dephosphorylation itself as well as the Ras-MEK-ERK- and Ras-PI3K-Akt signal pathways, which lead to cofilin dephosphorylation, are arginine- independent within the first 30 min of T cell activation. Later on, arginine deficiency leads to reduced phosphorylation of ERK but increased phosphorylation of Akt, and this correlates with impaired dephosphorylation of cofilin. Finally, the observed alterations of the T cell signal transduction pathways were also demonstrated upon T cell stimulation in a micromilieu that was depleted of arginine by liberated granulocyte arginase from human pus. This model emphasizes the physiological relevance of the described T cell alterations for granulocyte-dominated inflammation in vivo. The results of this thesis advance the understanding of regulatory mechanisms in human T cells under conditions of arginine deficiency and will hopefully enable improved pharmacological treatment of unwanted immune suppression caused by tumours and chronic inflammation.