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Toxicogenomics: Genexpressionsanalysen zur Charakterisierung und Identifizierung genotoxischer Verbindungen

Böhme, Kathleen

English Title: Toxicogenomics: Gene expression profiling for characterization and identification of genotoxic compounds

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PDF, German (Dissertation Kathleen Boehme)
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Abstract

Die in vitro-Testsysteme der derzeitigen Standardbatterie für die toxikologische Charakterisierung genotoxischer Verbindungen, insbesondere die Tests an Säugerzellen, sind hoch sensitiv, besitzen aber eine geringe Spezifität. Dadurch wird die Ergebnisinterpretation und Extrapolation der humanen Gefährdung erschwert. Diese Schwierigkeiten, aber auch ökonomische und tierschutzbedingte Aspekte, indizieren die Entwicklung neuer spezifischer in vitro-Systeme. Das Ziel dieser Arbeit war es ein neues genomicsbasiertes in vitro-Testsystem für die Identifizierung mutagener und promutagener Verbindungen zu entwickeln. Im ersten Teil der Arbeit wurden HepG2-Zellen nach Behandlung mit den mutagenen Testsubstanzen Etoposid, Actinomycin D und Methylmethansulfonat über 6h, 24h und 48h mit Illumina HumanRef-8 BeadChip Arrays global profiliert. Für die Testsubstanzen konnten 66 unidirektional regulierte Gene identifiziert werden, welche in Signalwege, wie P53-abhängige Apoptose, Chromatinumbauprozesse und oxidativen Stress, involviert waren. Aufgrund der signifikanten P53-vermittelten DNA-Schadensantwort wurde die Bestimmung des Tumorsuppressors P53 als putativer Genotoxizitätsmarker evaluiert. Die Quantifizierung von aktiviertem P53 im Kernextrakt von HepG2-Zellen bestätigte eine signifikante Induktion von P53 bei allen untersuchten Mutagenen. Im nächsten Teil der Arbeit sollte das entwickelte Testsystem auf progenotoxische Substanzen erweitert werden. Eine besondere Herausforderung war es, die benötigte metabolische Aktivierung in vitro nachzustellen. Die Charakterisierung der Zelllinie HepG2 in Bezug auf ihre fremdstoffmetabolisierende Kompetenz zeigte, dass die Zellen über eine begrenzte metabolische Kapazität verfügen. Zur Ergänzung des zellulären Metabolismus wurde ein kombiniertes Zellkultursystem mit Rattenleber-S9-Fraktionen als System zur metabolischen Aktivierung (MAS) etabliert. Während Cyclophosphamid (CPA) nur in Anwesenheit von S9 einen Anstieg an aktiviertem P53 zeigte, konnte für 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) und Aflatoxin B1 (AFB1) auch ohne MAS eine Induktion von P53 nachgewiesen werden. Um die metabolische Aktivierung dieser beiden Substanzen durch die HepG2-Zellen selbst zu bestätigen, wurden spezifische CYP-Enzyminhibitionstests durchgeführt. Eine Inhibition von zellulärem CYP3A4 oder CYP1A/1B1 führte zu einer verminderten AFB1- bzw. DMBA-vermittelten P53-Induktion. Dies indiziert, dass HepG2 die Fähigkeit besitzen, diese Substanzen CYP1A/1B1/3A4-abhängig zu metabolisieren. Nach den P53-Studien wurden globale Genexpressionsprofile mit Illumina BeadChips nach Behandlung der HepG2-Zellen mit den ausgewählten progenotoxischen Verbindungen CPA, AFB1, DMBA und Diethylnitrosamin (DEN) angefertigt und gemeinsam mit den Profilen der genotoxischen Testsubstanzen analysiert. Zur Evaluierung von Gemeinsamkeiten in den Genexpressionssignaturen dieser Verbindungen wurde ein computerbasiertes Klassifikationsmodell erstellt. Für das Modell wurde ein Trainingsdatensatz aus den (pro-)genotoxischen Substanzen sowie den beiden Negativkontrollen THEO und MET zusammengestellt. DEN wurde als „unbekannte“ Testsubstanz aus dem Datensatz ausgegliedert. Ein ANOVA-basiertes Ranking in Verbindung mit dem Support-Vektormaschinen (SVM)-Algorithmus mit dem Trainingsdatensatz ergab die beste Klassifikationsrate unter Verwendung der 91 top-rangierten Gene. Eine k-fache Kreuzvalidierung, welche anschließend zur Evaluierung der Prädiktivität des Klassifikationsmodells eingesetzt wurde, zeigte, dass alle als genotoxisch annotierten Substanzen auch korrekt eingeordnet worden. Mit dem erstellten Klassifikationsmodell wurde DEN als unbekannte Testsubstanz ohne die Zugabe von S9 als nicht-genotoxisch, in Anwesenheit eines metabolischen Aktivierungssystems hingegen als genotoxisch eingestuft. Insbesondere diese Daten bekräftigen die Verwendung von Genexpressionsmustern für das Screening genotoxischer Substanzen. DEN konnte in P53-Studien auch unter Zugabe von S9 keine signifikante Erhöhung an aktiviertem P53 bewirken, wurde aber anhand der Genexpressionsveränderungen nach metabolischer Aktivierung korrekt als genotoxisch eingestuft. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass (pro-)mutagene Verbindungen charakteristische Genexpressionsveränderungen in HepG2-Zellen induzieren. Die evaluierten 91 putativen Markergene können für die Identifizierung des genotoxischen Potentials unbekannter Substanzen herangezogen werden. Zudem konnte anhand der P53-Experimente gezeigt werden, dass mit Hilfe der Genexpressionsprofile neue Marker für genotoxische Substanzen entdeckt werden können, die ein schnelleres Screening ermöglichen.

Translation of abstract (English)

Despite having a high sensitivity, the current genotoxicity tests of the standard in vitro battery for compound assessment, especially those using mammalian cells, are characterized by low specificity. This high rate of false positive results complicates any interpretation and extrapolation to human hazard. These difficulties in the current genotoxicity testing strategy, as well as economic and animal welfare aspects, indicate the importance for the development of new in vitro tools. The aim of this study was to develop a new genomics-based test system for the identification of mutagens and promutagens in vitro. Gene expression profiles of the mutagenic test compounds etoposide (ETO), actinomycin D (ACT) and methyl methansulfonate (MMS) were determined in HepG2 cells after 6h, 24h and 48h of treatment using Illumina HumanRef-8 BeadChip arrays. Expression analysis revealed 66 unidirectionally regulated genes with functions in P53-dependent apoptotic signaling, chromatin remodeling and oxidative stress pathways. Significant regulation of P53-mediated DNA damage response genes prompted further evaluation of P53, as a putative marker for genotoxicity. A significant P53 induction was detected in nuclear protein extracts of HepG2 cells after 24 h and 48 h treatment in response to all mutagens tested. Subsequently, the current project aimed to extend the test system to progenotoxic compounds. Testing promutagens is a challenge because metabolic activation has to be reproduced in vitro. Hence, prior to the investigation of promutagenic compounds, HepG2 cells were characterized regarding their metabolic competency. The characterization results indicated that the cell line has a limited metabolic capacity prompting the application of a co-treatment with rat liver S9, used as a metabolic activation system (MAS) for the promutagen studies. While cyclophosphamide (CPA) showed an elevation of activated P53 in the presence of S9 only, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) and aflatoxin B1 (AFB1) responded in the absence of the MAS. To confirm the HepG2-dependent metabolic activation of DMBA and AFB1, specific CYP inhibition studies were performed. These studies revealed that inhibition of CYP3A4 or CYP1A/1B suppressed the AFB1- and DMBA-mediated P53 response, respectively, indicating that HepG2 cells are capable to metabolize these compounds in a CYP1A/1B/3A4-dependent manner. Global gene expression profiling was performed in HepG2 cells treated with selected progenotoxic compounds (CPA, AFB1, CPA, DMBA and N-Nitrosodiethylamine (DEN)) using Illumina BeadChip arrays. Beside the identification of common gene regulations for the progenotoxic test group, the work was focused on the development of a computer-based classification model, including also compounds which cause DNA-damage via a direct mode of action (ACT, ETO, MMS). For building the model a training data set was built out of the (pro-)genotoxic group and theophylline and metformin as negative controls. DEN was used as an “unknown” test compound and therefore, excluded from the training set. The best classification was achieved using the 91 top-scored genes, which were identified by gene Ranking with an ANOVA for group separation followed by support vector machine (SVM) algorithm for classifier calculation. The predicitvity was evaluated by k-fold cross validation, showing an appropriate group allocation according to the specified annotation. Thereafter, the classifier built from the training set was then used to predict the toxicity of DEN. DEN was classified as non genotoxic without S9 and genotoxic in the presence of the MAS. In particular, these data support the use of gene expression patterns for screening genotoxicants. This was highlighted by the fact that DEN was not able to induce P53 significantly but was classified correctly as genotoxic after metabolic activation by means of its gene expression signature. In summary, the results of the thesis demonstrated that (pro-)mutagenic compounds induced characteristic gene expression patterns in HepG2 cells. The 91 putative marker genes found may be used in the future for the identification of the genotoxic potential of unknown compounds. Furthermore, the P53 experiments confirmed the suitability of gene expression profiling for the discovery of novel markers for genotoxic compounds, allowing a more rapid screening of these substances.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Petersen, Prof. Dr. Gabriele
Date of thesis defense: 26 August 2010
Date Deposited: 29 Sep 2010 11:06
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Genomik, Toxikologische Bewertung, Mutagenitätstest, Microarray, DNS-Schädigung, Aflatoxin B1, Etoposid, Actinomycin D, Cyclophosphamid, Dime
Uncontrolled Keywords: Nitrosodiethylamin , MethylmethansulfonatGenomics , Toxicology , Microarray , Genotoxicity
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