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Molecular pathways important for the pathogenesis and risk stratification of childhood T-ALL

Kox, Corinne

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Abstract

Paediatric T-cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) is a rare type of cancer that represents 10-15% of ALL cases. Intensified chemotherapy led to improvements of the overall survival rates of childhood T-ALL, reaching approximately 80%. However, the prognosis of relapses remains poor, emphasising the need for new molecular markers that identify high risk patients in the earliest stages of the disease. In addition, understanding of the precise mechanisms of T-ALL leukaemogenesis allows for the development of molecular targeted therapies that could potentially improve the quality of life of children with T-ALL, in general, and the response in patients that develop recurrent disease, in particular. Frequent genetic abnormalities in T-ALL are mutations in the NOTCH pathway which are thought to drive T-ALL development. In the first part of this study, the prognostic and predictive value of mutations in the NOTCH pathway was investigated in T-ALL patients, at initial presentation and at relapse. Activating mutations in the NOTCH1 gene and inactivating mutations in the FBXW7 gene, encoding for a negative regulator of the pathway, were correlated with early treatment response and long-term outcome. At initial presentation, NOTCH1 mutated patients treated according to the ALL-BFM 2000 protocol show improved early treatment response and better long-term outcome. Interestingly, the NOTCH1 effect is restricted to the ALL-BFM 2000 good responders only. In the high risk group, patients with and without NOTCH1 mutations do not show a significant difference in long-term outcome. In contrast, inactivation of the FBXW7 protein correlates with excellent early response, but does not associate with better long-term outcome. At relapse, event-free survival rates were low in the ALL-REZ 2002 study, not exceeding 40%. In particular, FBXW7 mutated patients with recurrent disease showed a poor response to treatment. This study laid foundations for the possible application of molecular markers in T-ALL risk stratification. In the second part of this PhD work, the effect of up-regulated NOTCH signalling on microRNA expression was analysed to gain insight into the pathogenic mechanisms of NOTCH1 in T-ALL. In a cell-based assay, NOTCH1 was knocked down in a T cell line and mature microRNA expression was monitored by microarray profiling. Two normalisation methods were employed for the microarray analysis. The first method identified 5 microRNAs down-regulated upon NOTCH1 knock-down, including members of the miR-17~92 and miR-106~363 clusters. However, no major changes in miRNA expression were observed when using the second normalisation method. The validation of the microarray experiments by microRNA-specific quantitative PCR confirmed the results from the second microarray normalisation method. In comparison, a qPCR approach detected a down-regulation of primary microRNA transcripts, such as the transcript of the miR-17~92 cluster. In a second setting, the effect of NOTCH1 mutations on microRNA expression was determined in primary T-ALL patient samples. Marginal differences in expression were detected in members of the miR-17~92 cluster and the miR-181 family. Further work will be required to elucidate the mechanism of action of miRNA regulation by NOTCH1 in T-ALL.

Translation of abstract (German)

Die T Zell lymphoblastische Leukämie (T-ALL) ist ein seltener Krebstyp, der meistens bei Kindern auftritt, und nur 10-15% der ALL ausmacht. Die Krankheit zeichnet sich in den letzten Jahren durch immer höhere Überlebenschancen aus. Eine Ausnahme stellen rezidivierte Patienten dar, weswegen die Früherkennung von Hochrisikopatienten und deren schnelle intensive Therapie besonders wichtig ist. Eine individuelle Behandlung ab der Diagnose könnte die Überlebensrate der Hochrisikopatienten verbessern. Um die Diagnose des Rezidivrisikos sicher vorhersagen zu können, fehlen allerdings zuverlässige Marker. Des Weiteren ist es wichtig die Mechanismen der Pathogenese der T-ALL besser zu verstehen und hierauf aufbauend zielorientierte Therapien zu entwickeln. Individuelle Behandlungen könnten die Lebensqualität der Kinder mit T-ALL, und auch speziell das Therapieansprechen von rezidivierten Patienten verbessern. Häufige genomische Veränderungen in der T-ALL sind Mutationen im NOTCH Signalweg, die auch mitverantwortlich sind für die Entwicklung der Leukämie. Im ersten Teil der vorliegenden Studie wurden die Mutationen in Genen des NOTCH-Signalweges mit der Prognose der T-ALL Patienten korreliert. NOTCH1 enthält aktivierende Mutationen in 50% der Patienten, während FBXW7, ein Repressor von NOTCH1, inaktiviert wird durch Mutationen in weniger als 20% der T-ALL Patienten. Diese Mutationen wurden verglichen mit dem Ansprechen auf die Therapie, sowie mit dem Langzeitergebnis in der Erstdiagnose und im Rezidiv. In der Erstdiagnose der ALL-BFM 2000 Studie konnte ein positiver Effekt von NOTCH1 Mutationen auf das Therapie- und das Lanzeitergebnis nachgewiesen werden. Der NOTCH1-Effekt konnte lediglich in den Patienten festgestellt werden, die gut auf die Therapie angesprachen. In der Gruppe der Hochrisikiopatienten übte die NOTCH1 Mutation keinen Unterschied auf die Überlebensrate aus. Inaktivierende FBXW7 Mutationen korrelierten auch mit exzellentem Ansprechen der Patienten, es konnte allerdings keine Assoziation zwischen diesem Typ Mutation und eines verbesserten ereignisfreiem Überleben festgestellt werden. In Übereinstimmung mit den Erwartungen, überschritt die Überlebensrate bei rezidierten Patienten der ALL-REZ 2002 nicht mehr als 40%. Insbesondere Patienten mit FBXW7 Mutationen schlugen allgemein schlecht auf die Rezidivtherapie an. Diese Studie hat den Grundstein für den möglichen klinischen Gebrauch von Mutationen des NOTCH Signalweges gelegt. Im zweiten Teil dieser Studie wurde der Effekt von NOTCH1 Mutationen auf die Expression von microRNAs untersucht, um die Konsequenzen der NOTCH1 Aktivierung zu verstehen. In einem Zell-basierten Assay, wurde NOTCH1 in einer T-Zelllinie herabreguliert und die Expressionsprofile von reifen microRNA-Molekülen mit einer Microarray-Analyse untersucht. Zwei Normalisierungsmethoden wurden für die Analyse angewendet. Die erste Methode identifizierte 5 microRNA-Moleküle, die herabreguliert waren, darunter Mitglieder der miR-17~92 und miR~106-363 Cluster. Eine zweite Normalisierung konnte dagegen keinen Unterschied in den Expressionsprofilen von Kontroll- und NOTCH1-herabregulierten Experimenten aufzeigen. Die spezifische Amplifizierung der microRNA-Kandidaten durch quantitative PCR (qPCR) bestätigte die Resultate der zweiten Normalisierungsmethode, da keine Unterschiede in der Expression der microRNA-Moleküle entdeckt werden konnten. Die qPCR-Analyse konnte allerdings zwei primäre microRNA-Transkripte identifizieren, die nach einer Herabregulation von NOTCH1 ebenfalls herabreguliert waren: die Transkripte des miR-17~92-und des miR-491-Clusters. Zusätzlich wurden microRNA-Profile von T-ALL-Erstdiagnoseproben auf den Effekt von NOTCH1 Mutationen überprüft. Marginale Unterschiede in der Expression von microRNA-Molekülen aus dem miR-17~92-Cluster und der miR-181-Familie wurden ermittelt. Zukünftige Studien werden notwendig sein, um die genauen Mechanismen der miRNA-Regulation von NOTCH1 in T-ALL zu untersuchen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Ladurner, Dr. Andreas
Date of thesis defense: 13 October 2010
Date Deposited: 05 Nov 2010 07:27
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Gen notch, Small RNA, T-Zell-Leukämie, Biomarker, Pathogenese
Uncontrolled Keywords: microRNA
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