Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Modified Oligonucleotides : Investigations and Applications of the Diels-Alderase Ribozyme

Wahl, Florentine

German Title: Modifizierung von Oligonukleotiden : Untersuchungen und Anwendungen des Diels-Alderase Ribozyms

[img]
Preview
PDF, English
Download (15Mb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

The hypothesis of the origin of life was fundamentally changed by the discovery of catalytic RNA. The fascinating fact that RNA can function as a catalyst in the formation of carbon-carbon bonds, thereby creating enantiomeric centers and thus potential building blocks for life-sustaining structures, is of great importance to those who wish to understand biocatalytic processes. Ribozymes are generally identified by in vitro selection. Such an artificial ribozyme was utilized for the work presented in this dissertation; specifically, the Diels-Alderase ribozyme was the focus of the investigation. This ribozyme catalyzes a Diels-Alder reaction between anthracene and maleimide. The work presented herein revolved around modifications of oligonucleotides on different levels. Modification of RNA with organic moieties is indispensable for effective in vitro selection of such ribozymes. This thesis consists of three parts. In the first, new pathways were established for the synthesis of modified guanosine monophosphates (GMPs). The ability of the enzyme T7 RNA polymerase to incorporate these modified GMPs during transcription priming coined the term initiator nucleotides. The syntheses of a substituted anthracene and aldehyde-modified initiator nucleotides connected with a flexible polyethylene glycol linker were realized in just three synthetic steps. The incorporation of the initiator nucleotides into short RNA transcripts was investigated, as well as their incorporation into an RNA library with a randomized region eligible for in vitro selection. Excellent incorporation rates up to 77% were obtained for the transcription into the RNA library. The reactivity of thereby modified RNA molecules was subsequently studied in chemical reactions. Whereas the anthracene derivative could be reacted in a Diels-Alder reaction, the aldehyde led to full conversion in the reaction with hydrazides. In the second part of this thesis, the effect of divalent metal ions on the folding and stability of the Diels-Alderase ribozyme was studied in UV thermal denaturation experiments. Low concentrations of Mg2+ cations led to secondary structure stabilization of up to 85°C. Thermal denaturation studies of the wild-type ribozyme and comparison to mutants complement other ongoing investigations of the complex interplay of non-standard base pairs and triples in the ribozyme structure. While the wild-type ribozyme exhibited a significant stabilization in the presence of Mg2+ cations, a comparable stabilization of the mutants could not be observed. In accordance with the findings in other studies, the best interpretation of this effect on stability was that the mutants, despite their ability to form a pseudoknot structure, could not undergo further compaction. In the third part of this thesis, the Diels-Alderase ribozyme, which causes a remarkable acceleration of the Diels-Alder reaction rate, was successfully used as a catalyst for fluorescently labeling oligonucleotides in cis and in trans. Investigations of the substrate specificity of the ribozyme revealed that only fluorescent maleimide dyes with five carbon atoms next to the dye were accepted as substrates. This distinct feature was utilized as a bioorthogonal labeling strategy for the Diels-Alder bioconjugation of anthracene-modified oligonucleotides with equimolar proportions of fluorescent dyes. A new dual orthogonal labeling strategy was achieved by using an iodoacetamide dye for the thiol modification and a maleimide dye for the anthracene modification within the same DNA strand. For the anthracene modification, the Diels-Alderase ribozyme was employed as a catalyst.

Translation of abstract (German)

Die Entdeckung, dass RNA katalytische Eigenschaften aufweist, beeinflusste die Hypothese über den Ursprung des Lebens fundamental. Für das Verständnis biokatalytischer Prozesse ist die faszinierende Tatsache, dass RNA die Bildung neuer Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungen katalysieren und dabei Stereozentren generieren kann von entscheidender Bedeutung. Die vorliegende Arbeit basiert auf der Erforschung und Anwendung eines solchen Ribozyms - des Diels-Alderase Ribozyms. Dieses Ribozym katalysiert die Diels-Alder Reaktion zwischen Anthracen und Maleimid. Ribozyme werden grundsätzlich durch in vitro Selektion identifiziert. Ein wichtiges, zentrales Thema dieser Arbeit ist die Modifikation und Funktionalisierung von Oligonukleotiden. Die Modifikation von RNA durch funktionelle Gruppen ist für die in vitro Selektion derartiger Ribozyme unverzichtbar. Im ersten Teil der Arbeit wurden neue Synthesewege chemisch modifizierter Guanosinmonophosphate (GMP) untersucht. Die Fähigkeit des Enzyms T7 RNA-Polymerase während der Transkription GMP spezifisch als erste Base einzubauen, prägte dabei den Namen Initiatornukleotid. Die Darstellung eines Anthracen-Derivates und eines Aldehyds mit einem flexiblen Polyethylenglykol-Linker konnte in nur drei Syntheseschritten erreicht werden. Der Einbau der Initiatornukleotide in kurze RNA-Transkripte wurde ebenso wie der Einbau in eine für die in vitro Selektion geeignete RNA-Bibliothek mit randomisiertem Bereich untersucht und optimiert. Dabei konnten Inkorporationsraten bis zu 77% für den Einbau in die RNA Bibliothek erzielt werden. Anschließend wurde die Reaktivität der dabei modifizierten RNA Moleküle untersucht. Das Anthracen-Derivat konnte in einer Diels-Alder Reaktion umgesetzt werden, während der Aldehyd vollständig mit Hydraziden reagierte. Im zweiten Teil wurde der Einfluss zweiwertiger Metallionen auf die Faltung und Stabilität des Diels-Alderase Riboyzms in UV-Denaturierungsexperimenten untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass bereits geringe Konzentrationen von Mg2+-Kationen in der Lage sind, die Sekundärstruktur bis 85°C zu stabilisieren. Studien zur thermischen Denaturierung des Wildtyps sowie Mutanten ergänzen andere laufende Studien zur Erforschung des komplexen Zusammenspiels ungewöhnlicher Basenpaarungen und Basentripel in der Ribozymstruktur. Obwohl beim Wildtyp eine signifikante Stabilisierung durch Mg2+ festgestellt wurde, konnte eine ebensolche Stabilisierung der Mutanten nicht nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit anderen Studien kann dies so interpretiert werden, dass die Mutanten, trotz ihrer Fähigkeit einen Pseudoknoten zu bilden, keine weiter Kompaktierung erfahren. Im dritten Teil der Arbeit wurde das Diels-Alderase Ribozym, welches eine bemerkenswerte Reaktionsbeschleunigung hervorruft, erfolgreich als Katalysator für die Markierung von Oligonukleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen sowohl in cis als auch in trans, eingesetzt. Untersuchungen zur Substratspezifität haben gezeigt, dass nur Maleimide-Derivate mit fünf Kohlenstoffatomen zwischen Maleimid und Fluoreszenzfarbstoff als Substrat erkannt werden konnten. Dieses distinktive Merkmal konnte genutzt werden, um eine neue bioortogonale Markierungsmethode für Anthracen-modifizierte Oligonukleotiden mit equimolaren Mengen an Fluoreszenzfarbstoffen zu schaffen. Eine neue zweifach orthogonale Markierungsmethode von Modifikationen im gleichen DNA-Strang konnte erzielt werden, indem für Thiol-Modifikationen Iodoacetamid- und für die Anthracen-Modifikation Maleimid-Fluoreszenzfarbstoffe verwendet wurden. Dabei wurde das Anthracen in einer Ribozym-katalysierten Diels-Alder Reaktion umgesetzt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jäschke, Prof. Dr. Andres
Date of thesis defense: 3. March 2011
Date Deposited: 25. Mar 2011 15:14
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Ribozym, Diels-Alder-Reaktion, Fluoreszenzmarkierung, Biokatalysator
Uncontrolled Keywords: Biokonjugation , InitiatornukleotideDiels-Alderase ribozyme , bioorthogonal labeling oligonucleotides , fluorescence , bioconjugation , initiator nucleotides
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative