Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Development of LSPR-based optical biosensors for the label-free detection of biomolecular interactions in high-density peptide arrays

Liu, Fanny Caroline

German Title: Entwicklung LSPR-basierter optischer Biosensoren zum markierungsfreien Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen in hochintegrierten Peptidbibliotheken

[img]
Preview
PDF, English
Download (70Mb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Peptide or protein chips which can track hundreds or thousands of distinct proteins from a blood or urine sample at a single step are highly desired. It will allow the diagnosis of diseases in their formative, treatable stages just by detecting proteins that are markers for these specific diseases. To simultaneously and efficiently detect where blood´s proteins bind on the grid, label-free detection methods are favorable in order to reduce time and cost demands and facilitate the detection of low-affinity binding events. In this work, a label-free biosensor based on localized surface plasmon resonance (LSPR) was developed and specifically optimized regarding its application as a solid substrate in the synthesis of high-density peptide arrays, and in the detection of molecular interactions occurring on the sensor surface. Three main issues which are crucial in achieving this goal have been covered in this work: (i) development and optimization of the LSPR biosensor, (ii) Synthesis of a protein resistant layer on the LSPR biosensor, (iii) Label-free detection of biomolecular interactions on the polymer coated LSPR biosensors. For this purpose, a LSPR-based biosensor was first constructed. It consists of two gold layers and an intermediate dielectric layer in-between. The LSPR biosensor shows several pronounced resonance peaks in the UV-visible region of the electromagnetic spectrum, which are highly sensitive to changes in the refractive index of the surrounding medium. The LSPR biosensor was optimized in terms of plasmon resonance line shape, optical homogeneity, and sensitivity to facilitate its application in the label-free detection of biomolecular interactions in array format. In a second step, a poly(ethylene glycol) based polymer was synthesized on the sensor surface at mild reaction conditions by using Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP). The sensor was first coated with a silica gel to stabilize the sensor and provide a sufficiently high number of functional groups. ATRP initiators were immobilized on the silica gel surface in 2 steps by silanization and esterification to enhance the coupling efficiency. Subsequently, polymerization was carried out with oligo(ethylene glycol) methacrylate (OEGMA) as the monomer resulting in a poly(ethylene glycol) methacrylate (PEGMA) polymer film. In the second approach, a graft copolymer film was synthesized on the sensor surface with methyl methacrylate (MMA) as the diluting monomer in order to reduce the protein-resistance of the sensor coating and further enhance the sensor stability. Graft copolymer films with 10% PEGMA/ 90% MMA and a thickness of 50-60 nm were successfully synthesized by setting the polymerization time between 9.5 and 10.5 hours. This thickness regime is required to ensure a high-loading of amino functional groups, which serve as the starting point for the subsequent peptide array synthesis. At the same time, this film thickness does not exceed the surface sensitivity regime of the LSPR biosensor. To test the performance of the LSPR biosensor, an array of fluorescent-labeled antibodies was formed on its surface by a spotting robot. The LSPR image displays an array of spots which corresponds to the fluorescence image. Moreover, the quantity of antibody bound to the sensor surface was correctly predicted based on the measured wavelength shifts in the quadrupole regime and a mass sensitivity factor known from literature. This shows that the LSPR biosensor described in this thesis has the potential to allow the detection of molecular interactions in a miniaturized array format in a quantitative manner. In the final part of this thesis, the polymer-coated LSPR biosensor was successfully utilized as the solid substrate in the synthesis of a peptide array via a novel laser printing technique developed at the Cancer Research Center Heidelberg (DKFZ). An array with 9x20 variants of hemagglutinin/HA (YPYDVPDYA) epitope was synthesized on a polymer-coated LSPR biosensor and incubated with IR-dye conjugated specific antibody. The LSPR image was generated by evaluating the wavelength shift in the octapole resonance peak and has successfully displayed the entire peptide array formed on the sensor surface. In a separate study, the potential of single, small particles for biosensing applications in miniaturized format was investigated. Whispering gallery modes (WGM) of fluorescence-doped sulfonated polystyrene (PS) particles with a diameter of 2 µm were studied with respect to their resonance shift after adsorption of polyelectrolyte multilayers. The resonance shifts were plotted as a function of the film thickness and a slope of 0.038 nm/ Å was obtained from a linear fit to the experimental data. This sensitivity factor can be translated into a detection limit of 3 fg by assuming a spectral resolution of 0.1 nm and a polyelectrolyte mass density17 of 0.81 g/cm3.

Translation of abstract (German)

Peptid- oder Proteinchips, die Hunderte oder Tausende unterschiedliche Proteine aus einer Blut- oder Urinprobe in einem einzigen Schritt aufspüren können, sind in der medizinischen Diagnostik von großem Interesse. Bei der parallelen und effizienten Erkennung spezifischer Proteine sind markierungsfreie Detektionsmethoden von Vorteil, da sie einerseits zeit- und kosteneffizient sind und andererseits auch schwache Bindungen nachweisen können. In dieser Arbeit wurde ein markierungsfreier Biosensor entwickelt, der auf lokalisierter Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) basiert, und insbesondere bezüglich seiner Anwendung als ein festes Substrat in der Synthese hochintegrierter Peptidbibliotheken sowie der Erkennung biomolekularer Wechselwirkungen optimiert. Drei zentrale Fragen, die zur Erreichung dieses Ziels entscheidend sind, wurden in dieser Arbeit behandelt: (i) die Herstellung und Optimierung des LSPR-Biosensors, (ii) die Herstellung einer protein-resistenten Beschichtung auf dem LSPR-Biosensor, und (iii) die markierungsfreie Detektion biomolekularer Wechselwirkungen auf dem Polymer-beschichteten LSPR-Biosensor. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein LSPR-basierter Biosensor entwickelt. Der LSPR-Biosensor zeigt mehrere ausgeprägte Resonanzpeaks im UV-Vis Spektrum, die hochempfindlich auf Änderungen des Brechungsindex des umgebenden Mediums reagieren. Der LSPR-Biosensor wurde im Hinblick auf die Linienform der Plasmonenresonanz sowie seine optische Homogenität und Empfindlichkeit optimiert. Im zweiten Schritt wurde ein Polyethylenglykol (PEG) basierter Polymerfilm als protein-resistente Beschichtung auf dem LSPR-Biosensor mit Hilfe der Atom Transfer Radikal Polymerisation (ATRP) synthetisiert. Der Sensor wurde hierbei zuerst mit einen Silikagel beschichtet und ATRP-Initiatoren wurden auf der Silikageloberfläche durch Silanisierung und anschließende Veresterung immobilisiert. Anschließend wurde die Polymerisation mit Oligoethylenglykolmethacrylat (OEGMA) und Methacrylsäuremethylester (MMA) als Monomeren durchgeführt. Copolymerfilme mit 10% PEGMA/ 90% MMA und einer Filmdicke von 50-60 nm wurden erfolgreich durch die Einstellung der Polymerisationszeit auf 9,5 bis 10,5 Stunden synthetisiert. Diese Filmdicke ist erforderlich, um eine ausreichende Anzahl funktioneller Amino-Gruppen zu gewährleisten, welche als Ausgangspunkt für die anschließende Synthese eines Peptidarrays dienen. Gleichzeitig bleibt die Schichtdicke im Empfindlichkeitsbereich des LSPR-Biosensors. Um die Leistungsfähigkeit des LSPR-Biosensors zu überprüfen, wurde ein Array fluoreszenzmarkierter Antikörper auf dessen Oberfläche gespottet. Das LSPR-Bild zeigt eine Reihe von Spots, die mit dem Fluoreszenzbild korreliert. Außerdem konnte die Menge der oberflächengebundenen Antikörper anhand der gemessenen Wellenlängenverschiebung in der Quadrupolresonanzpeak und einem aus der Literatur bekannten Empfindlichkeitsfaktor korrekt vorhergesagt werden. Dies zeigt, dass der in dieser Arbeit optimierte LSPR-Biosensor das Potenzial besitzt, molekulare Wechselwirkungen in einem miniaturisierten Arrayformat quantitativ nachzuweisen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde der polymerbeschichtete LSPR-Biosensor erfolgreich als festes Substrat für die Synthese eines Peptidarrays mithilfe einer neuen Laserdrucktechnik eingesetzt, die am Krebsforschungszentrum Heidelberg entwickelt wurde. Ein Array mit 9x20 Varianten des HA Epitops (YPYDVPDYA) wurde auf einer polymerbeschichteten LSPR-Biosensor synthetisiert und mit einem IR-Farbstoff konjugierten anti-HA Antikörper inkubiert. Die Bindungsereignisse auf dem Sensor wurden dann mittels eines IR-Scanners und markierungsfreiem LSPR-Imaging nachgewiesen. Das LSPR-Bild wurde durch Auswertung der Wellenlängenverschiebung des Octapolresonanzpeaks erzeugt und konnte erfolgreich den gesamten Peptidarray auf der Sensoroberfläche darstellen. In einer separaten Studie wurde das Potenzial einzelner kleiner Teilchen für biosensorische Anwendungen im Miniaturformat untersucht. Hierzu wurden sogenannte Whispering Gallery Modes (WGM) in Fluoreszenz-dotierten sulfonierten Polystyrol (PS) Partikeln mit einem Durchmesser von 2 µm erzeugt und ihre Resonanzverschiebung nach der Adsorption von Polyelektrolyten untersucht. Bei einer Auftragung der gemessenen Resonanzverschiebung als Funktion der Schichtdicke ergibt sich ein linearer Zusammenhang, der sich durch eine Gerade mit einer Steigung von 0,038 nm/Angstrom; anpassen lässt. Dieser Empfindlichkeitsfaktor ergibt unter der Annahme einer spektralen Auflösung von 0,1 nm und einer Polyelektrolytdichte von 0,81 g/cm3 eine Nachweisgrenze von 3 fg für diesen Einzelpartikelsensor.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dahint, Prof. Dr. Reiner
Date of thesis defense: 11 February 2011
Date Deposited: 12 Apr 2011 15:50
Date: 2011
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: Biophysikalische Chemie , optischer Biosensor , Oberflächenplasmonenresonanz , ATRPbiophysical chemistry , optical biosensor , surface plasmon resonance , peptide array , ATRP
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative