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Funktionelle Studien zur Signaltransduktion von Klotho

Krop, Friederike

English Title: Functional studies of Klotho signal transduction pathways

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PDF, German
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Abstract

Klotho ist ein Typ I Transmembranprotein, das als solches oder nach Abspaltung seiner extrazellulären Domäne als sezernierter löslicher Faktor eine Rolle in einer Vielzahl an Signaltransduktionwegen spielt. So kann Klotho z.B. die Wirkung von Wachstumsfaktoren, wie FGF23, Insulin, IGF1 und Wnt modulieren. Über einen bisher ungeklärten Mechanismus hemmt Klotho die Phosphorylierung des IGF1R und damit den nachgeschalteten PI3-Kinase/Akt-Signalweg. Da der IGF1R ein validiertes Target für die Krebstherapie ist und es Hinweise auf eine Funktion von Klotho als Tumorsupressor gibt, könnte Klotho selbst oder ein synthetischer Klothorezeptor-Agonist ein vielversprechendes Therapeutikum für die zukünftige Behandlung maligner Tumore darstellen. Grundvoraussetzung für derartige Ansätze ist jedoch ein besseres Verständnis der Klotho-vermittelten Signaltransduktion und die Identifizierung aller Klothorezeptoren. In dieser Arbeit wurde daher die Inhibition des IGF1-Signalweges durch Klotho näher untersucht. Als erstes wurden hierzu adäquate Modellsysteme identifiziert und eine Reihe von Werkzeugen, u.a. verschiedene Klothovarianten, hergestellt. Mit Hilfe einer Liganden-Affinitätschromatographie sowie eines gezielten „Screenings“ einer „Orphan“ GPCR Rezeptorbibliothek sollte dann ein Rezeptor für Klotho identifiziert werden, der nach Bindung von Klotho die Inhibition der IGF1-Signaltransduktion vermittelt. Für diese Zwecke und weitere pharmakologische Studien wurde die extrazelluläre Domäne von Klotho mit einem Fc-„Tag“ kloniert, in CHO-Zellen stabil exprimiert und Klotho-Fc aus dem Überstand dieser Klone gereinigt. Trotz der nachgewiesenen biologischen Aktivität und einer robusten, salzstabilen zellulären Bindung von Klotho-Fc an ausgewählte Zellen konnte weder in affinitätschromatographischen „Pull-Down“-Experimenten noch im „Orphan-Screen“ ein spezifischer Interaktionspartner bzw. Rezeptor von Klotho identifiziert werden. In einem parallelen Ansatz wurde eine im Laufe dieser Arbeit von Wolf et al. (2007) neu beschriebene Bindung der Transmembranform von Klotho an den IGF1R untersucht und geklärt, ob eine solche Bindung auch für die lösliche extrazelluläre Domäne von Klotho besteht, da diese Domäne allein die Inhibition der IGF1-Signaltransduktion vermittelt. Es konnte jedoch weder mittels Co-Immunpräzipitation bzw. „Pull-Down“ die Bindung der Transmembranform an den IGF1R uneingeschränkt verifiziert noch mit Hilfe von Co-Immunpräziptation, Analysen mittels Durchflusszytometrie und Biacore-Experimenten Hinweise auf eine Bindung der extrazellulären Domäne gefunden werden. Daher besteht weiterhin die Annahme, dass die Inhibition des IGF1-Signalweges nicht über den IGF1R sondern einen bisher unbekannten Klothorezeptor vermittelt wird. Zusätzlich durchgeführte Microarray-Studien mit Klotho-sensitiven Zellen konnten zwar keine unmittelbaren Hinweise auf den gesuchten putativen Klothorezeptor geben, zeigten jedoch eine signifikante Induktion einer Vielzahl Zellzyklus-assoziierter Gene durch Klotho, die in dieser Weise und diesem Umfang bisher nicht bekannt war. Mit 81 dieser Gene konnte mit Hilfe der MetaCore Software ein fundiertes Netzwerk erstellt werden, das funktionelle Interaktionen zwischen den einzelnen Genen bzw. Proteinen aufzeigt. Diese Ergebnisse bieten neue Einblicke in die Funktion von Klotho in der Tumorentstehung und -progression und eine interessante Grundlage für weitere Studien.

Translation of abstract (English)

Klotho is a type I single-pass transmembrane protein that is implicated in multiple signal transduction pathways. For example it modulates the signaling of multiple growth factors, including FGF23, insulin, IGF1 and Wnt signaling. It can either act as transmembrane form or after shedding and secretion of its extracellular domain as humoral factor. By a not yet fully elucidated mechanism Klotho inhibits phosphorylation of the IGF1R and thereby downstream PI3-Kinase/Akt signaling. Since the IGF1R is a validated target in cancer therapy and there is evidence for a function of Klotho as tumor suppressor, Klotho itself or synthetic Klotho receptor agonists may be promising therapeutics for future treatment of malignant tumors. A basic requirement for these approaches is a better understanding of Klotho mediated signal transduction and the identification of all Klotho receptors. Therefore, in this work the inhibition of the IGF1 signaling pathway was analyzed in detail. First of all adequate model systems were identified and a set of tools, e.g. different Klotho variants, were established. By ligand affinity chromatography and selective screening of an orphan GPCR receptor library a receptor for Klotho that mediates the inhibition of the IGF1 signal transduction should be identified. For this purpose and further pharmacological studies an Fc-tagged extracellular domain of Klotho was cloned, stably expressed in CHO cells and purified from supernatant of stably transfected cells. Despite of an evident activity and a robust salt-insensitive cellular binding of Klotho-Fc to selected cell lines, it was not possible to identify a specific interaction partner by affinity chromatography or orphan screening. In a parallel approach binding of the transmembrane form of Klotho to the IGF1R, which was described in the course of this work by Wolf et al. (2007), was analyzed. Furthermore, binding of the extracellular domain of Klotho to the IGF1R was studied, because this domain alone is able to mediate the inhibition of the IGF1R signal transduction. Co-immunoprecipitation, pull-down and flow cytometry analysis as well as Biacore experiments clearly demonstrated that secreted Klotho does not bind to IGF1R and suggest that corresponding published data may be artefacts. These findings further substantiate the hypothesis that another Klotho receptor exists that mediates the inhibition of the IGF1 signaling pathway. Microarray studies with Klotho sensitive cells did not provide any clear link to the nature of this putative Klotho receptor, but revealed a link between Klotho signal tranduction and cell cycle regulation. Using the MetaCore software it was possible to construct a well-founded network including 81 upregulated genes that discloses functional interactions. These results provide new insights into the function of Klotho in tumor development and progression and offer an interesting basis for further studies.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Petersen, Prof. Dr. Gabriele
Date of thesis defense: 17. March 2011
Date Deposited: 14. Apr 2011 13:12
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Klotho , IGF1R-SignalwegKlotho , IGF1R signaling
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