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Studies on homotypic and heterotypic communications in chaperone protein ClpB from T. thermophilus

Auvula, Rajeswari

German Title: Untersuchungen der homotypischen und heterotypischen Kommunikation des Chaperonproteins ClpB aus T. thermophilus

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Abstract

ClpBTth is a molecular motor, which exerts an ATP hydrolysis driven mechanical force, resulting in disaggregation of aggregated proteins. ClpBTth belonging to the AAA family of ATPases carries the signature AAA module, which comprises of a large nucleotide binding domain (NBD) and an α-helical small domain (SD). The two tandem AAA modules present per subunit of ClpBTth interact with each other and the neighboring AAA modules in the hexameric ring-like structure. The current study focuses on inter-subunit (homotypic) and intra-subunit (heterotypic) communications between the AAA modules in ClpBTth oligomer, in respect to nucleotide binding and hydrolysis. The two tandem AAA modules of ClpBTth upon isolation exhibit unique properties. The isolated AAA2 module more or less represents a building block for the full-length hexameric protein. It appears to have retained most of the key characteristics, exhibited by full-length ClpBTth, as evident by sigmoidal kinetics in ATP hydrolysis and nucleotide binding-related conformational changes. So, nucleotide binding in the isolated AAA modules was investigated using fluorescently labeled proteins to gain insights into the nucleotide-mediated oligomer dissociation. Experiments were performed using the isolated AAA modules to reduce the complexity which comes with studying full-length hexamer. Experiments provided hints for involvement of the α-helical small domain 2 in nucleotide-dependent oligomer formation. Importance of the presence of SD2 has been demonstrated; upon its deletion, isolated AAA2 domain lost nucleotide binding and hydrolysis. Studies using a mutant carrying proline mutation in a loop connecting SD2 to NBD2 in the AAA2 module revealed loss of chaperone and ATPase activity. This study pointed out at the importance of flexibility and motion in SD2 of the AAA2 module. Nucleotide binding studies hinted at a possible biphasic nature and inter-subunit communication. ADP binding in one AAA2 module appeared to have triggered a conformational change in SD2 of the neighboring AAA2 module. These results gave insights into the conformational changes involved in ADP-mediated oligomer dissociation in ClpBTth. Although oligomer dissociation has been linked to ADP binding/formation in several instances, the inter-subunit communications pattern has never been clearly discerned. This work provides a platform for further studies to investigate conformational changes that result in oligomer formation and dissociation. The isolated AAA modules of ClpBTth upon reconstitution exhibit functional higher order oligomer formation. This reconstituted complex resembles wild type ClpBTth hexamer in all aspects related to oligomerization, chaperone activity and ATP hydrolysis. So, complex formation between the isolated AAA modules was studied to understand the thermodynamics behind the communication between them. Isothermal titration calorimetry measurements were performed to study binding between the isolated AAA modules. Experiments provided hints at temperature dependency in binding between the AAA modules in ClpBTth. Allostery in ATP hydrolysis is central to the function of ClpBTth, which represents both homotypic and heterotypic communications between the AAA modules. Absence of heterotypic allostery always resulted in a loss of function in ClpBTth. Importance of heterotypic allosteric communications between the AAA modules within each subunit and their role in chaperone activity of ClpBTth was investigated in this work. This was done by alteration of the related interface by mutating amino acids involved in interface interactions. Most of the mutants resulted in subtle changes in nucleotide hydrolysis properties and heterotypic allostery. Changes in allosteric behavior did not translate into a loss in chaperone activity, as evident by no loss of function in mutants exhibiting altered allostery. Experiments in the presence of GdmCl, which acts as an uncompetitive inhibitor for ATP binding, additionally revealed interesting insights to the allostery-defective situation in ClpBTth. Furthermore, this study has shed some light on possible mechanisms involved for attaining catalytic effectiveness in ClpBTth.

Translation of abstract (German)

ClpBTTh ist ein molekularer Motor, welcher eine durch ATP-Hydrolyse getriebene mechanische Kraft ausübt, die zur Disaggregation von Proteinaggregaten führt. ClpB gehört zur Familie der AAA-ATPasen und besteht aus AAA-Modulen, die sich aus einer Nukleotidbindedomäne (NBD) und einer kleinen a-helicalen Domäne (SD) zusammensetzen. Zwei AAA-Module auf einer Untereinheit interagieren sowohl untereinander als auch mit anderen AAA-Modulen auf benachbarten Untereinheiten innerhalb eines ringförmigen hexameren Komplexes. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Kommunikation innerhalb und zwischen den Untereinheiten des oligomeren ClpBTTh Komplexes hinsichtlich der Nukleotidbindung und Hydrolyse. In Isolation zeigen die zwei AAA-Module jeder Untereinheit einzigartige Charakteristika. Das isolierte AAA2 Modul repräsentiert in gewisser Hinsicht einen Baustein für den hexameren Komplex aus voll-längen ClpB. Es scheint die meiste Schlüsseleigenschaftern des voll-längen ClpB beibehalten zu haben, ersichtlich durch die sigmoidale steady-state ATPase Kurve sowie nukleotidabhängige Konformationsänderungen. Um Einblicke in die nukleotidabhängige Dissoziation der Untereinheiten zu gewinnen, wurde die Nukleotidbindung an die isolierten AAA-Module mittels fluoreszenzmarkierter Proteine gemessen. Die isolierten Module wurden verwendet, um die Komplexität der voll-längen Konstrukte zu reduzieren. Die durchgeführten Experimente ergaben hinweise auf einer Rolle der kleinen a-helikalen Domäne in nukleotidabhängiger Oligomerisierung. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit der kleinen a-helikalen Domäne sehr wichtig ist, da das Entfernen dieser Domäne im isolierten AAA2-Modul zum Verlust von Nulkleotidbindung und ATP-Hydrolyse führt. Untersuchungen an einer AAA2 Variante, die eine Prolin-Mutation innherhalb einer Loop-Region enthält, welche die SD2-Domäne mit der NBD2-Domäne verbindet, zeigten, dass diese Variante weder Chaperon- noch ATPase-Aktivität zeigt. Dies deutet darauf hin, dass die Flexibilität dieser Region eine wichtige Rolle spielt. Untersuchungen der Nukleotidbindung deuten auf eine mögliche zwei-phasige Bindung hin sowie auf Kommunikation zwischen benachbarten Untereinheiten. ADP Bindung in einer Untereinheit könnte demnach eine Konformationsänderung in der SD2 einer benachbarten Untereinheit auslösen. Diese Resultate geben Hinweise auf Konformationsänderungen, die einer ADP-induzierte Auflösung von ClpBTTh- Oligomeren zugrunde liegen. Obwohl ADP-Bindung und Oligomer-Dissoziation schon in einigen Fällen miteinander in Verbindung gebracht werden konnte, konnte das Muster der Kommunikation zwischen den Untereinheiten nicht eindeutig aufgeklärt werden. Die vorliegende Arbeit stellt eine Plattform für zukünftige Arbeiten dar, welche Konformationsänderungen untersuchen, die zur Auflösung und Assemblierung von Oligomeren führen. Die zwei isolierten AAA-Module (AAA1 und AAA2) rekonstituieren, wenn sie gemischt werden, zu funktionellen Oligomeren. Dieser rekonstituierte Komplex ähnelt den Eigenschaften vom voll-längen wildtyp ClpBTTh in allen Apekten bezüglich der Oligomerisierung, der Chaperon-Aktivität und der ATP-Hydrolyse. Deshalb wurde die Bildung von Komplexen zwischen den isolierten AAA-Modulen untersucht mit dem Ziel die Thermodynamik der Kommunikation zwischen diesen zu verstehen. Um dies zu erreichen wurden Messungen mittels Isothermer Titrationskalorimetrie durchgeführt. Diese Experimente legen eine Temperaturabhängigkeit der Bindung der AAA-Module von ClpBTTh nahe. Allosterie in der ATP-Hydrolyse ist Zentral für die Funktion von ClpBTTh, welches sowohl homotypische Kommunikation – d.h. Kommunikation zwischen gleichen AAA-Modulen – als auch heterotypische Kommunikation - d.h. Kommunikation zwischen verschiedenen AAA-Modulen – aufzeigt. Die Abwesenheit heterotypischer Allosterie hatte immer den Verlust der Funktion zur Folge. Die Bedeutung der heterotypischen allosterischen Kommunikation zwischen den AAA-Modulen einer Untereinheit und die Auswirkung dieser auf die Chaperonaktivität wurde in dieser Arbeit untersucht. Dies wurde erreicht durch Mutation von Aminosäuren, welche Interaktionen innerhalb der Grenzfläche zwischen den AAA-Modulen bilden. Die meisten Mutationen zeigten feine Unterschiede in ATP-Hydrolyse und heterotypischer Allosterie. Die veränderte Allosterie übertrug sich jedoch nicht auf eine veränderte Chaperonaktiviät, da Varianten mit veränderter Allosterie keinen Verlust der Chaperonaktivität zeigten. Experimente in Anwesenheit von GdmCl, welches ein unkompetetiver Inhibitor für die Bindung von ATP ist, erbrachten weitere Einblicke in die Störung der Allosterie von ClpBTTh. Weiterhin beleuchtete diese Arbeit einen möglichen Mechanismus zur Erlangung von katalytischer Effektivität in ClpBTTh.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Reinstein, Dr. PD. Jochen
Date of thesis defense: 20 April 2011
Date Deposited: 06 May 2011 11:24
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Max-Planck-Institute allgemein > MPI for Medical Research
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: ClpB , Thermus thermophilusClpB , Thermus thermophilus
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