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Characterisation of the drug transport properties of the Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter through expression in Xenopus laevis oocytes

Dave, Anurag

German Title: Charakterisierung der Medikamentetransporteigenschaften von Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter durch Expression in Xenopus laevis oozyten

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With an annual mortality of around a million people, most of whom are children, malaria remains a major health hazard in our times. Amongst the drugs used to treat malaria, compounds such as chloroquine (CQ) and quinine (QN) are no longer the first line antimalarials in use because of the spread of drug resistant Plasmodium falciparum, in particular that of the chloroquine resistant (CQR) strains. Central to CQR malaria is the Plasmodium falciparum chloroquine transporter (PfCRT), a trans-membrane protein located in the digestive vacuolar membrane of the parasite. It has been shown in the past that mutations in this protein are linked to an enhanced efflux of CQ from the digestive vacuole, which is the basis of CQR in P. falciparum. As part of this study, PfCRT was expressed in oocytes of Xenopus laevis, in order to understand the relationship between mutant pfcrt and transport of quinoline drugs. A number of naturally occurring and lab-constructed pfcrt mutants were expressed in oocytes, and transport measured for CQ, QN and its stereoisomer quinidine (QD). The data obtained showed that apart from being a carrier for CQ, mutant PfCRT exhibited saturable and verapamil-sensitive uptake of QN and QD, suggesting that PfCRT is a carrier for QN and QD as well. Using polymorphic pfcrt alleles, it was observed that mutations in pfcrt can influence the apparent Michaelis-Menten constant for CQ. While all mutant pfcrt alleles showed uptake of CQ albeit with differences, only the Dd2 and GB4 alleles showed transport for QN and QD, indicating that pfcrt mutations may also influence the substrate specificity. Mutants generated for the Ecu1110 alleles showed that only three mutations can suffice for CQ transport. Amino acid substitution in the Dd2 allele revealed a role for residue 326 in quinoline substrate selectivity. Taken together, the data argue in favour of a model where PfCRT acts as a carrier for quinolines such as CQ and QN, whose kinetic parameters are dependent on the actual combination of mutant residues present.

Translation of abstract (German)

Mit einer jährlichen Sterblichkeit von rund einer Million Menschen, von denen die meisten Kinder sind, bleibt Malaria eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten unserer Zeit. Unter den Medikamenten die zur Bekämpfung von Malaria eingesetzt werden sind Chloroquin (CQ) und Chinin (QN) nicht mehr die erste Wahl. Der Grund dafür ist die sich immer weiter ausbreitender Resistenz von Plasmodium falciparum gegen antimalaria Medikamente, insbesondere gegen CQ. Die Zentrale Rolle bei der CQ Resistenz spielt der Plasmodium falciparum Chloroquin resistance transporter (PfCRT), ein in der Nahrungsvakuole des Parasiten lokalisiertes transmembranes Protein. Es wurde gezeigt, dass Mutationen innerhalb dieses Proteins mit einem erhöhten Efflux von CQ aus der Nahrungsvakuole einhergehen. Um die Zusammenhänge zwischen mutiertem pfcrt und dem Transport von Chinolinen zu verstehen, wurde PfCRT in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert. Es wurden natürlich vorkommende sowie im Labor hergestellte Varianten von pfcrt in Oozyten exprimiert, anschließend wurde der Transport von CQ, QN und seines Isomers Quinidine (QD) gemessen. Die erhaltenen Daten zeigen, dass mutierte PfCRT Varianten außer CQ auch QN und QD transportieren. Es konnte auch beobachtet werden, dass Mutationen in PfCRT auch einen Einfluss auf die Michaelis-Menten Konstante für CQ haben. Während alle mutierten PfCRT Allele, wenn auch mit Unterschieden, Aufnahme von CQ zeigten, war nur im Fall von Dd2 and GB4 Allelen Transport von QN und QD zu beobachten, was darauf hindeutet, dass Mutationen in PfCRT auch einen Einfluss auf die Substratspezifität haben könnten. Versuche mit Ecu1110 Mutanten zeigen, dass nur drei Mutationen für den CQ Transport ausreichend sind. Die Ersetzung der Aminosäure an Position 326 im Dd2 Allel bewirkt eine Substratselektivität der Chinoline. Zusammenfassend sprechen die Daten für ein Modell, in dem PfCRT als Transporter für Chinoline wie CQ und QD fungiert, deren kinetische Parameter von der jeweiligen Kombination der mutierten Aminosäuren abhängen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Lanzer, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 25 May 2011
Date Deposited: 21 Jun 2011 12:11
Date: 2011
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Department for Infectiology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Malaria tropica, Plasmodium falciparum, Glatter Krallenfrosch, Carrier-Proteine, Multidrug-Resistenz
Uncontrolled Keywords: Malaria tropica , Plasmodium falciparum , Xenopus laevis , Carrier protein , Multidrug resistance , Chloroquine , Quinine
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