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A novel AAV9 random peptide library to select for endothelial cell – directed gene transfer vectors

Varadi, Karl

German Title: Eine neuartige randomisierte AAV9-Peptidbibliothek zur Selektion von Endothelzell-gerichteten Gentransfer-Vektoren

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Abstract

Endothelial cells play a central role in vascular diseases and represent therefore a clinically relevant cell type for gene therapeutic approaches. However, the endothelium is difficult to transduce with wtAAV vectors at feasible levels. The potential of random peptide libraries displayed on AAV2 to select for AAV2 vectors with improved efficiency of endothelial-directed gene transfer has been demonstrated. AAV9, however, may have advantages over AAV2 because of a lower prevalence of neutralizing antibodies in humans and more efficient gene transfer in vivo. The present study provides evidence that random peptide libraries can be displayed on AAV9 and can be utilized to select for AAV9 capsids redirected to human endothelium, as previously shown for AAV2. An AAV9 peptide display library which ensures that the displayed peptides correspond to the packaged genomes was generated. Four consecutive selection rounds on human coronary artery endothelial cells (HCAEC) performed in vitro yielded AAV9 library capsids with distinct peptides that strongly outperformed transduction of wild type AAV9. A central point of this study is posed by the finding that incorporation of sequences selected from AAV2 libraries into AAV9 capsids could not increase transduction as efficient as peptides selected in the AAV9 library context, justifying the generation and selection of an AAV9 library. Furthermore, AAV9 vectors with targeting sequences selected from AAV9 libraries revealed an increased transduction efficiency in presence of neutralising human intravenous immunoglobulins suggesting a reduced immunogenicity and a better suitability of AAV9 as a vector backbone. However, enriched peptides did not restrict AAV9 specificity towards HCAEC. The attempt to restrict transgene expression to this cell type by transcriptional targeting using a murine endothelium-specific promoter may be promising as an additional targeting level. To determine the potential of selected AAV on endothelial cells in the intact natural vascular context, murine mesenteric arteries and human umbilical veins were incubated in vivo or in situ, respectively, using the most efficient AAV9 vector. Analysis revealed a highly efficient transduction of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) by the vector mutant. Similar to the negligible transduction by wtAAV9 vectors, no transduction of murine mesenteric artery endothelial cell (MMAEC) could be detected. A closer comparative analysis of two selected vectors displaying peptides with divergent sequences revealed a HSPG-independent transduction of and the partial use of a common transduction. The results obtained in the present study permit the conclusion that the novel AAV9 peptide library is functional and can be used to select for vectors for future preclinical and clinical gene transfer applications.

Translation of abstract (English)

Endothelzellen spielen eine zentrale Rolle in vaskulären Erkrankungen und stellen daher ein klinisch relevantes Ziel für gentherapeutische Ansätze dar. Die Transduktion des Endothels mit Hilfe von Wildtyp AAV (wtAAV)-Vektoren ist jedoch ineffizient. Die Selektion von randomisierten Peptidbanken, die im Kontext der AAV2-Kapsidoberfläche exprimiert wurden, hat das Potential zur Detektion und Herstellung von AAV2-Vektormutanten mit gesteigerter Transduktionseffizienz bezüglich des Endothels gezeigt. Es ist jedoch denkbar, das AAV9 als Serotyp aufgrund des niedrigeren Vorkommens neutralisierender Antikörper im Menschen und einer effizienteren Gewebstransduktion in vivo für die Konstruktion und Selektion solcher Peptidbanken besser geeignet ist. Die vorliegende Studie beweist, dass die Herstellung einer solchen AAV9-Peptidbank möglich ist und eine Selektion auf Endothelzellen ähnlich wie im Falle von AAV2 zur Isolation von Endothel-gerichteten AAV9-Vektormutanten führt. Die nach vier aufeinander folgenden in vitro-Selektionsrunden auf humanen koronarartriellen Endothelzellen (HCAEC) angereicherten AAV9 Kapsidvarianten wiesen Transduktionseffizienzen auf, welche die von wtAAV9-Vektoren bei weitem übertrafen. Eine Expression von Peptiden, die im Rahmen einer AAV2-Bibliotheksselektion auf HCAEC isoliert wurden, auf AAV9-Vektoren ergab deutlich niedrigere Transduktionswerte im Vergleich zu Peptiden, die aus AAV9-Bibliotheken selektiert wurden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die selektierten AAV9-Vektoren eine erhöhte Transduktion in Gegenwart neutralisierender humanen intravenösen Immunoglobuline aufweisen, wodurch eine geringere Immunogenizität angenommen werden kann und AAV9 als den besser geeigneten Serotyp für diesen Zweck erscheinen lässt. Diese Ergebnisse zeigen gemeinsam die Überlegenheit der AAV9 Peptidbibliotheken. Nachfolgende Untersuchungen haben jedoch gezeigt, das die angereicherten Peptide AAV9 keine erhöhte Gewebsspezifität verleihen. Der Einsatz Endothel-spezifischer Promotoren konnte die Spezifität der Transgenexpression jedoch etwas erhöhen. Um das Potential der selektierten AAV-Vektoren zur Transduktion von im Blutgefäßkontext residierenden Endothelzellen zu bestimmen, wurden humane Nabelschnurvenen einer in situ und murine Mesenterialarterien einer in vivo Behandlung mit dem effizientesten Vektor unterzogen. Im Gegensatz zur hocheffizienten Transduktion der Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) durch die Vektormutante, ermöglichte der Wildtyp-Vektor keinen Gentransfer. Überraschenderweise konnte keine Endotheltransduktion der murinen Mesenterialarterien durch die Vektormutante detektiert werden. Eine nähere Charakterisierung zweier Vektormutanten, die Peptide mit divergierender Sequenz exprimierten, ergab eine HSPG-unabhängige Transduktion zweier Zelltypen und wies auf eine partiell gemeinsame Nutzung des Transduktionspfades hin. Die vorliegenden Resultate erlauben den Rückschluss, dass die im Rahmen dieser Studie entwickelte AAV9-Peptidbank funktionell und zur Selektion von Vektoren geeignet ist, welche in künftigen präklinischen und klinischen Gentransferstudien eingesetzt werden könnten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kleinschmidt, Prof. Dr. Jürgen
Date of thesis defense: 28 September 2011
Date Deposited: 12 Oct 2011 11:50
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: AAV , Bibliothek , Endothel , Gentransfer , SelektionAAV , library , endothelium , gene transfer , selection
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