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Assembly and Activation of the Plasmodial Pyridoxal 5’-Phosphate Synthase Complex. Understanding the Structural Mechanism of PLP Biosynthesis

Guédez Rodríguez, Gabriela Liuvanova

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Abstract

Biosynthesis of vitamin B6 is essential for all living cells. Most organisms use the pyridoxal 5’-phosphate (PLP) synthase complex to synthesize the cofactor form, PLP, from the three substrates ribose 5-phosphate (R5P), glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) and ammonia. PLP synthase complex is a glutamine amidotransferase (GATase) class I, consisting of 12 Pdx1 and 12 Pdx2 subunits. Pdx1 is responsible for the PLP synthesis and Pdx2 is the glutaminase that hydrolyses glutamine to produce ammonia, which is transfered to the Pdx1 active site. In this PhD Thesis, studying Pdx1 and Pdx2 proteins from the human parasite Plasmodium falciparum and from the rodent parasite Plasmodium berghei gave important insights into the assembly, activation and substrate tunneling of the PLP synthase complex. Electron microscopy analyses showed that association of the PLP synthase and glutaminase subunits was random, suggesting a non cooperative mechanism independent of neighboring Pdx1 binding sites to be occupied by Pdx2. Complex assembly is critical for glutamine hydrolysis by Pdx2, although the presence of an ammonia acceptor in the Pdx1 active site did neither enhance the Pdx1/Pdx2 interaction nor the catalytic rate of Pdx2 in vitro, as tested by biophysical and kinetic experiments. In particular, the PLP synthase complex does not show allosteric activation by R5P or glutamine binding that would result in synchronization of the glutaminase and PLP synthesis reactions. Therefore, the Pdx1/Pdx2 interaction is enough to stimulate glutamine hydrolysis. A particular motivation of this Thesis was to crystallize the PLP synthase complex from the malaria causing parasite, P. falciparum, for the potential use of the 3D structure in drug design. However, the complex assembled into fibers in vitro, induced by the Pdx1 subunit, making the crystallization trials of this enzyme impossible. A chimeric complex formed by Pdx1 from P. berghei and Pdx2 from P. falciparum proved to be a catalytically active system, suitable for structural studies of the plasmodial complex. Crystal structure of this enzyme complex gave two major advances in the understanding how prokaryotic and eukaryotic PLP synthase complexes resemble each other or differ in protein interaction and activation. Variations at the Pdx1/Pdx2 interface occur through insertion sequences in eukaryotic systems, notably in the plasmodial PLP synthase complex by the loop 95-111 in Pdx2. Activation of the glutaminase is highly conserved in both systems. The process entails reorganization of structural regions at the Pdx1/Pdx2 interface through stabilization of alpha-N and the oxyanion hole region. Activation of the PLP synthase requires a helical segment, named alpha-2’, for sugar binding. The helix is observed in two alternative positions in the Pdx1/Pdx2 and Pdx1-R5P structures: an open conformation to allow the entrance of the substrate and a closed conformation oriented towards R5P, sequestering the substrate in the catalytic center. The pentose substrate is bound in the P1 site to the catalytic Lys84 via a Schiff base with the ribose C1 atom. GATases are characterized by two separate active sites for glutamine hydrolysis and enzyme-specific metabolite syntheses. Previously, ammonia transfer between two catalytic centers was proposed to occur by flexible methionine residues within a transient tunnel in Pdx1. The plasmodial proteins show an ammonia tunnel distict from bacterial orthologs as some of the residues lining the passage are exchanged. Biochemical analysis confirmed that the (beta/alpha)8 -barrel of Pdx1 passes the reactive ammonia produced in Pdx2 to Pdx1 active site, assigning function of key residues for the ammonia channeling. The differences between eukaryotic and prokaryotic systems provide insight into PLP synthase complex regulation, which may be exploitable in drug design for the treatment of malaria.

Translation of abstract (German)

Die Biosynthese von Vitamin B6 ist wichtig für alle lebenden Zellen. Die meisten Organismen nutzen den Pyridoxal 5’-phosphat (PLP) Synthase Komplex um den PLP Cofaktor aus den drei Substraten Ribose-5-Phosphat (R5P), Glyceraldehyd 3-Phosphat (G3P) und Ammoniak zu bilden. Der Enzyme-Komplex ist eine Glutamin Amidotranstransferase (GATase) der Klasse I, bestehend aus 12 Pdx1 und 12 Pdx2 Untereinheiten. Pdx1 ist verantwortlich für die PLP-Synthese und Pdx2 ist eine Glutaminase, die Glutamin zu Ammoniak hydrolysiert um es auf Pdx1 zu ubertragen. In dieser Doktorarbeit geht es im Wesentlichen um das Studium der Pdx1 und Pdx2 Proteine aus dem menschlichen Parasiten Plasmodium falciparum und dem Mausmalaria Parasiten Plasmodium berghei. Diese Studie gibt dabei wichtige Einblicke uber Aufbau, Aktivierung und Substrat-Tunneling des PLP-Synthase-Komplex. Elektronen mikroskopische Analysen zeigten, dass die Komplexbildung zwischen Pdx1 PLP-synthase und Pdx2 Glutaminase Untereinheiten eher zufällig abläuft, was auf einen nicht kooperativen Mechanismus hindeuted, der unabhängig davon ist, ob benachbarte Bindungsstellen am Pdx1-Ring von Pdx2 Untereinheiten besetzt sind. Die Komplexformierung ist entscheidend für die Glutamin-Hydrolyse durch Pdx2, obwohl die Anwesenheit eines Ammoniumionakzeptors im aktiven Zentrum von Pdx1 weder zu einer Zunahme der Pdx1/Pdx2 Interaktion noch der Pdx2 katalytische Rate führt, was durch biophysikalische und kinetische Experimente belegt ist. Insbesondere weist der PLP-Synthase-Komplexe keine allosterische Aktivierung durch R5P- oder Glutamin- Bindung auf, was in einer Synchronisierung der Glutaminase- und der PLP-Synthese-Reaktionen resultieren würde. Demzufolge ist die Pdx1/Pdx2 Interaktion ausreichend un die Glutamin Hydrolyse zu stimulieren. Eine besondere Motivation dieser Doktorarbeit war die Kristallisation des PLP Synthase-Komplex aus dem Malaria-Parasiten P. falciparum aufgrund seines potentiellen Einsatzes im Drug-Design. Allerdings aggregiertete der Komplex zu Fasern in vitro, induziert durch die Pdx1 Untereinheit. Die Kristallisation der PLP Synthase war deshalb nicht erfolgreich. Ein chimärer Komplex gebildet aus Pdx1 von P. berghei und Pdx2 von P. falciparum erwies sich als katalytisch aktives System, geeignet für strukturelle Untersuchungen am Plasmodium Komplex. Die Kristallstruktur liefert zwei bedeutende Beiträge zum Verständnis darüber, wie sich prokaryotische und eukaryotische PLP-Synthase-Komplexe in Proteininteraktion und -aktivierung ähneln oder unterscheiden. Variationen der Pdx1/Pdx2 Interaktion treten durch die Anwesenheit von Insertionssequenzen in eukaryotischen Systemen auf. In Plasmodium PLP Synthase-Komplexen ist die Loop-Region 95-111 in Pdx2 an der Komplexbildung beteiligt, welche in bakteriellen Pdx2 Enzymen deletiert ist. Die Aktivierung der Glutaminase ist in beiden Systemen hoch konserviert: eine Umordnung struktureller Regionen am Pdx1/Pdx2 interface führt zu einer Stabilisierung von Alpha-N und der Oxyanion- Region. Die Aktivierung der PLP-Synthase erfordert ein helicales Segment, genannt Alpha-2’, für die Bindung von Zucker molekülen, welches an zwei alternativen Positionen beobachtet wird: die offene Konformation in der Pdx1/Pdx2 Struktur erlaubt eine offene Konformation den Zugang für Substrate; dagegen wird in der Struktur des R5P Substrat Komplexes eine geschlossene Konformation beobachtet, die das Substrat im katalytischen Zentrum sequestriert. Das Pentose Substrat wird an der P1 Stelle des katalytischen Lys84 über eine Schiff- Base an das C1-Atom der Ribose gebunden. GATases haben zwei separate aktive Zentren, eines für die Ammoniak Produktion und eines für die Synthese Aktivität. Ein Modell des Ammoniak Transfers vermittelt durch flexible Methioninaminosäuren innerhalb eines transienten Kanals in Pdx1. Hier wird gezeigt, dass bei Plasmodien Proteinen einige der Reste dieses Kanals ausgetauscht sind. Die biochemische Analyse bestätigte, dass das (Alpha/Beta)8 -Barrel Ammoniak von Pdx2 zu Pdx1 transferiert. Durch Mutagenese Analysen wurde den Aminosäuren eine Funktion im Ammoniak - Channeling zugewiesen. Die Unterschiede zwischen eukaryotischen und prokaryotischen PLP-Synthase Systemen erlauben Einblicke in Enzymregulierung, welche für das Drug Design für die Behandlung von Malaria nutzbar sind.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sinning, Prof. Dr. Irmgard
Date of thesis defense: 29. September 2011
Date Deposited: 19. Oct 2011 12:13
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: pyridoxal 5-phosphate synthase , plasmodium , Pdx1 , Pdx2 , PLP biosynthesis , x-ray crystallography , ITC , AUC , EM, complex assembly
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