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Untersuchung der onkogenen Eigenschaften von HPV16 E7, E6 und E5 bei Expression unter Kontrolle ihrer viralen Promotoren und im Kontext des kompletten viralen Genoms in einem organotypischen in vitro Modellsystem

Bergner, Sven

English Title: Analysis of the oncogenic properties of HPV16 E7, E6 and E5 when expressed under control of their viral promotors and within the context of the complete viral genome by an organotypic in vitro model system

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Abstract

Das high-risk Humane Papillomavirus Typ 16 (HPV16) ist ursächlich verantwortlich für die Ausbildung von ca. 50% aller mehr als 500.000 jährlich auftretenden Zervixkarzinomfälle weltweit. Trotz der Einführung der hochwirksamen prophylaktischen HPV-Vakzine sind weiterhin Untersuchungen zum besseren Verständnis von Virus-Wirt-Interaktionen erforder-lich, die das grundlegende Verständnis für die virusinduzierte Progression einer benignen Neoplasie hin zu der Ausbildung eines Tumors erweitern. Bis heute sind die Effekte der HPV-Proteine hauptsächlich in Modellen erforscht worden, die ein oder zwei virale Onkogene unter der Kontrolle heterologer Promotoren berücksichtigen. Aus diesem experimentellen Ansatz resultiert eine Überexpression des jeweiligen Gens und die Aufklärung kooperierender Effekte mit anderen viralen Proteinen ist ausgeschlossen. Ziel dieser Arbeit war es daher, eine Analyse der biologischen Effekte der E5, E6 und E7 Onkogene von HPV16 in einem naturnahen in vitro Modell genauer zu charakterisieren. Dabei sollten die Onkoproteinfunktionen aller drei Gene im Vordergrund stehen, wenn sie unter der Kontrolle ihrer viralen Promotoren im Kontext des komplett vorliegenden Genoms exprimiert werden. Hierfür gelang es, ein transfektionsbasiertes System auf Grundlage eines loxp_HPV16_eGFP-N1-Vektoren zu etab¬lieren, das bei hoher episomaler Kopienzahl eine effiziente Manifestation von HPV16 ermög¬lichte. Benutzt wurden neben dem Wildtyp-Genom von HPV16 auch Punktmutanten aller drei Gene, die ein gezieltes „knock-out“ bewirkten. Durch eine Anpassung der Kulturbedingungen konnte die immortalisierte HaCaT-Zelllinie erstmals in organotypischer Raftkultur so kultiviert werden, dass eine Unterstützung des viralen Lebenszyklus möglich wurde. Konservierte HPV16-tragende epidermale Äquivalente bildeten dabei stark dysplastische Morphologien aus, die bisher in ähnlichen Systemen aus primären Keratinozyten bzw. bei der Verwendung der NIKS-Zelllinie nicht darstellbar waren. In Konsens mit den bekannten HPV16-Charakteris¬tiken war E7 in den vorliegenden Untersuchungen als Hauptmediator einer virusinduzierten Hyperproliferation identifizierbar. Konträr zu den allgemein anerkannten Wirkweisen von E7 und E6 resultierte hingegen die gesteigerte Proliferation nicht aus einer Degradation von pRb oder p53. Insgesamt legten sowohl die Histologie, die schwache Präsenz von E1^E4 und der ausgebliebene Nachweis einer L1-Expression den Schluss nahe, dass die erhaltenen Gewebe einer höhergradigen in vivo CIN-Läsion vergleichbar sind. Diese Ergebnisse erlauben eine teilweise neue Interpretation der Effekte der HPV-Onkogene auf die Zellproliferation und differenzierung der infizierten epithelialen Zellen. Weiterhin bietet das etablierte Modell die Möglichkeit in einem naturähnlichen System die Eigenschaften der Onkoproteine von HPV16 zu untersuchen.

Translation of abstract (English)

The high-risk Human Papilloma Virus type 16 (HPV16) is the causative etiological agent in approximately 50% of more than 500.000 cervical carcinoma cases worldwide each year. Despite the implementation of two highly effective prophylactic vaccines there is a constant need for research focused on the virus-host interaction that underlies virus induced progression from benign neoplasia to tumor development. So far the HPV protein functions were analyzed mainly by in vitro model systems where one or two viral oncogenes were expressed under control of heterologous promoters. The outcome of such experimental approaches is the overexpression of those genes, leaving out the elucidation of cooperative effects with other viral proteins. Therefore the aim of this thesis was the dissection from biological functions of the HPV16 oncogenes E5, E6 and E7 within an in vitro model reflecting near-natural conditions. Particularly the oncoprotein functions of E7, E6 and E5 when expressed under the control of their own promoter and in the presence of the complete viral genome were of special interest in this study. By establishing a transfection based system using a loxp_HPV16_eGFP-N1-vector high viral episomal copy numbers could be obtained. Used for this study were the wild-type HPV16 genome and also mutated genomes holding point mutations within the oncogenes causing a specific knock-out. Through the modulation of culture conditions it was possible to actively support a viral life cycle employing organotypic raft cultures of immortalized HaCaT cells for the first time. The resulting epidermal equivalents which carried HPV16 displayed pronounced dysplastic morphology, a phenotype which is not seen to such an extent in approaches employing both primary keratinocytes and the NIKS cell line. In agreement with previously published theories the results of this study confirm that E7 is of pivotal importance for the development of a hyperproliferation upon the virus infection. Surprisingly, the results reveal that the E7 and E6 mediated increase in proliferation does not result from the degradation of pRb or p53. Due to the histological features, the fact that E1^E4 was weakly expressed and L1 could not be detected it was suggested that the resulting in vitro tissues closely resemble higher grade CIN lesions in vivo. These results partially allow a new interpretation of the HPV16 oncogene effects on cell proliferation and differentiation within infected epithelial cells. Consequently, the in vitro system developed in this study will facilitate the analysis of the oncoprotein functions of HPV16 in a close to nature environment.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gissmann, Prof. Dr. Lutz
Date of thesis defense: 23. November 2011
Date Deposited: 28. Nov 2011 09:19
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Humanes Papillomavirus, Virales Onkogen, In-vitro-Kultur, Organkultur, Virusinfektion
Uncontrolled Keywords: in vitro Virionenproduktion , organotypische Raftkulturin vitro virion production , orgnaotypic raft culture
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