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Characterization of the SMC-hinge and MutL-homology domain (SMUDO) protein

Bohlmann, Mark

German Title: Charakterisierung des SMC-hinge and MutL-homology domain (SMUDO) Proteins

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Abstract

The recently discovered SMC-hinge and MutL-homology domain (SMUDO) protein was found to be a potential interaction partner of the stress induced homeodomain-interacting protein kinase 2 (HIPK2) which acts as a switching element in the DNA damage response. Upon severe DNA damage, HIPK2 induces apoptosis via p53-dependent as well as p53-independent pathways. SMUDO protein exhibits structural domains showing homology with the SMC and MutL protein families, both known for their involvement in DNA repair mechanisms. The aim of this thesis was to characterize the SMUDO protein and to investigate its putative connection to HIPK2 as well as its possible functions in the context of the DNA damage response. Early analysis by Northern blot, RT-PCR and Western blot revealed ubiquitous expression of SMUDO in human tissue samples as well as in diverse cell lines, suggesting functions that are not restricted to specific tissues. Various DNA damage pathways have been studied to find indications for a role of SMUDO, where the focus was on those in which HIPK2 participates. Several kinds of DNA damage, such as double or single strand breaks as well as pyrimidine dimers, were generated by Adriamycin treatment or UV, stimuli which are known to activate HIPK2. However, SMUDO levels showed no alterations under these conditions, and SMUDO knockdown had no effect on levels of HIPK2, p53 phosphorylated at Ser46 or other DNA damage response transducers. Pulldown experiments concerning HIPK2-SMUDO interaction support in vitro binding of the proteins, whereas in vivo interaction could not be confirmed by co-immunoprecipitation or immunofluorescence so far. This is probably due to SMUDO association to an insoluble fraction inside the nucleus, presumably chromatin. By FRAP technique, it could be shown that the SMC-hinge domain and the MutL domain of SMUDO influence the localization and mobility of the protein. The MutL domain seems to be responsible for a primarily nuclear localization of the protein and association with the insoluble nuclear fraction, while the SMC-hinge domain supports this association further limiting the mobility of SMUDO within the nucleus. Moreover, it could be demonstrated by co-immunoprecipitation that the SMC-hinge domain mediates SMUDO-SMUDO interaction. Summarized, a SMUDO-HIPK2 interaction in the context of the DNA damage response seems to be unlikely. However, functional cooperation of the proteins might take place within other cellular processes such as epigenetic regulation.

Translation of abstract (German)

Das kürzlich entdeckte SMC-hinge and MutL domain (SMUDO) Protein wurde als potentieller Interaktionspartner der Stress-induzierten Homeodomain-interacting protein kinase 2 (HIPK2), welche eines der entscheidenden Elemente der DNS-Schadensantwort ist, identifiziert. Nach massiven DNS-Schäden induziert HIPK2 Apoptose über p53-abhängige sowie über p53-unabhängige Signalwege. Das SMUDO-Protein besitzt strukturelle Domänen, welche Homologien zu den SMC- und MutL-Proteinfamilien, die beide für ihre Beteiligung an DNS-Reparaturmechanismen bekannt sind, aufweisen. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des SMUDO-Proteins und die Untersuchung sowohl seiner potentiellen Verbindung zu HIPK2 als auch seiner mögliche Rolle in der DNS-Schadensantwort. Frühe Analysen durch Northern Blot, RT-PCR und Western Blot ergaben eine ubiquitäre Expression von SMUDO in humanen Gewebeproben sowie in diversen Zelllinien, was auf eine Funktion des Proteins hinweist, die nicht auf ein spezifisches Gewebe beschränkt ist. Verschiedene DNS-Schadenssignalwege wurden untersucht, um Indizien für eine Funktion von SMUDO zu finden, wobei der Fokus auf Signalwegen lag, an denen HIPK2 teilhat. Unterschiedliche Arten von DNS-Schäden, wie Einzel- oder Doppelstrangbrüche sowie Pyrimidindimere, bekannte HIPK2-aktivierende Stimuli, wurden durch Adriamycin-Behandlung oder UV-Strahlung generiert. Jedoch zeigten die SMUDO-Proteinlevels keine Veränderung unter diesen Bedingungen. Auch hatte eine starke Reduzierung des SMUDO-Levels keinen Effekt auf die Levels von HIPK2, an Serin46 phosphorylierten p53 oder anderen Signaltransduktions-komponenten der DNS-Schadensantwort. Pulldown-Experimente die sich auf HIPK2-SMUDO-Interaktion beziehen, untermauern in vitro-Bindung der Proteine, wohingegen in vivo-Interaktion bisher noch nicht durch Ko-Immunpräzipitation oder Immunfluoreszenzfärbung bestätigt werden konnte. Dies liegt vermutlich an der Assoziation von SMUDO mit einer unlöslichen Fraktion des Nukleus, wobei es sich wahrscheinlich um Chromatin handelt. Durch FRAP-Techniken konnte gezeigt werden, dass die SMC-hinge- und MutL-Domänen von SMUDO die Lokalisation und Mobilität des Proteins beeinflussen. Die MutL-Domäne scheint für die primär nukleäre Lokalisation sowie für die Assoziation mit der unlösliche Fraktion verantwortlich zu sein, während die SMC-hinge-Domäne diese Assoziation unterstützt und damit die Mobilität von SMUDO innerhalb des Nukleus weiter einschränkt. Des Weiteren konnte demonstriert werden, dass die SMC-hinge-Domäne SMUDO-SMUDO-Interaktion vermittelt. Zusammengefasst ist eine SMUDO-HIPK2-Interaktion im Kontext der DNS-Schadensantwort unwahrscheinlich. Jedoch könnte eine funktionelle Kooperation der Proteine innerhalb anderer zellulärer Prozesse, wie der epigenetischen Regulation, stattfinden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Zawatzky, Prof. Dr. Rainer
Date of thesis defense: 21 November 2011
Date Deposited: 06 Dec 2011 15:11
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: SMUDO , SMCHD1 , DNA-damage response , HIPK2 , SMC proteins
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