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Electron microscopy and new technological approaches to investigate structural elements of the mitotic apparatus in Saccharomyces cerevisiae and Xenopus laevis

Heiligenstein, Xavier

German Title: Elektronenmikroskopie und neue technologische Ansätze zur strukturellen Untersuchung der Elemente des mitotischen Apparats in Saccharomyces cerevisiae und Xenopus laevis

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Abstract

The mitotic cell cycle is a complex process which leads to the chromosome segregation from the mother cell to the two daughter cells and transmit the full genetic background necessary to grow and adapt to the permanently evolving environment. The equal partitioning of the duplicated chromosomes is finely regulated by the cytoskeleton which on purpose organises into a mitotic spindle. In eukaryotes like Xenopus laevis and Saccharomyces cerevisiae the mitotic spindle is mainly composed of three components: first the microtubules (MT) are organised in a spindle emanating from the chromosomes and focusing at the poles. Second they connect to the chromosomes via the kinetochore complexes (KT) and third focus at the microtubule organising centres (MTOC), also called centrosomes. We have focused our interest on structural analysis of the S. cerevisiae centrosome, called the Spindle Pole Body (SPB), at the molecular level, and on the MTs organisation in the meiotic spindle midzone of X. laevis. With S. cerevisiae we have used cryo-electron tomography on vitreous sections (CETOVIS) to investigate the three dimensional (3D) molecular structure of the SPB. The samples were vitrified by high pressure freezing (HPF) and sectioned in vitreous state. Acquiring instant snapshots close to native state of the SPB in vivo, we confirmed previous observations done on plunge frozen or freeze substituted material. The Spc42 central crystal protein are organised with a defined spacing of 107Å, but the plaques composing the SPB could not all be identified. Mainly, the central and the outer plaque were visible, in contrast with the plastic tomography results where the inner plaque appeared dense and compact. Unfortunately, the very low signal to noise ratio prevented us from extracting details structural information about the SPB in its native state. The project concerning the X. laevis meiotic spindle focused on the 3D organisation of the MT within the spindle. Their interactions with the MTOC and the KT have been extensively studied over the past, but a high resolution structural map is still missing and has long been awaited by scientists to put all the knowledge into a 3D context. Furthermore, information about the individual MT is missing like their average length distribution, the existence of short MTs and the end morphologies distribution. To study this complex and large structure, we have developed a novel correlative light to electron microscopy (CLEM) approach combined with electron tomography. We cryo-fixed by HPF, for the first time to our knowledge, spindle assembled in X. laevis egg extracts and prepared them for a structural electron tomographic study. We reconstructed three quarter of a meiotic spindle midzone and identified three subcategories of MT bundle organisation. Finally, we have used our CLEM method to develop a new technology that should facilitate future CLEM work. Recent advances in plastic polymer transformation and micro-injection moulding (µIM) allowed us to create a cryocaspule designed for an easy correlative microscopy and transfer for HPF.

Translation of abstract (German)

Der mitotische Zellzyklus ist ein komplexer Vorgang, der zur Aufteilung der Chromosomen von der Mutterzelle auf die beiden Tochterzellen führt. Er überträgt damit den vollständigen genetischen Hintergrund der notwendig ist um zu wachsen und sich an das ständig verändernde Umfeld anzupassen. Die gleichberechtigte Teilung der verdoppelten Chromosomen ist durch das Zytoskelett, das sich absichtlich in eine mitotische Spindel organisiert, fein geregelt. In Eukaryoten wie Xenopus laevis und Saccharomyces cerevisiae setzt sich die mitotische Spindel vor allem aus drei Komponenten zusammen: erstens die Mikrotubuli (MT) sind in einer Spindel, die von den Chromosomen ausgehen und sich an den Polen konzentrieren, organisiert. Zweitens sie verbinden sich mit den Chromosomen über die Kinetochor-Komplexe (KT) und drittens sie bündeln sich an den Mikrotubuli Organisationszentren (MTOC), auch Zentrosomen genannt. Wir haben unser Interesse einerseits auf die strukturelle Analyse des S. cerevisiae Zentrosoms, des so genannten Spindelpolkörpers (SPB), auf molekularer Ebene, und andererseits auf die Organisation der MTs in der Mittelzone der meiotischen Spindel von X. laevis konzentriert. Bei S. cerevisiae haben wir Kryo-Elektronen-Tomographie auf amorphen Dünnschnitten (CETOVIS) verwendet, um die dreidimensionale (3D) Molekularstruktur des SPB zu untersuchen. Die Proben wurden mittels Hochdruckgefrierens (HPF) in amorphes Eis eingebettet und anschließend in amorphe Dünnschnitte geschnitten. Anhand von Momentaufnahmen nah am nativen Zustand des SPB in vivo, konnten wir frühere Beobachtungen, die an schockgefrorenem oder gefriersubstituiertem Material durchgeführt wurden, bestätigen. Die Spc42 zentralen Kristallproteine sind mit einem definierten Abstand von 107 Å organisiert, aber die Platten, aus denen sich der SPB zusammensetzt, konnten nicht alle identifiziert werden. Hauptsächlich waren die mittlere und äußere Platte sichtbar, im Gegensatz zu den Kunststoff-Tomographie Ergebnissen, wo die innere Platte dicht und kompakt erscheint. Leider verhinderte das sehr niedrige Signal-zu-Rauschverhältnis einen Gewinn von detaillierten strukturellen Informationen des SPBs in seinem nativen Zustand. Das Projekt über die X. laevis meiotische Spindel wurde auf die 3D-Organisation der MT in der Spindel ausgerichtet. Die Wechselwirkungen zwischen MT und MTOC und KT wurden ausführlich in der Vergangenheit studiert, aber eine strukturelle Karte mit hoher Auflösung fehlt noch und wird seit langem von Wissenschaftlern ersehnt, um all das Wissen in einen 3D-Kontext zu stellen. Darüber hinaus fehlen Informationen über die einzelnen MT, wie ihre durchschnittliche Verteilung der Länge, die Existenz kurzer MTs und die Verteilung der Endmorphologie. Zur Untersuchung dieser komplexen und großen Struktur, haben wir einen neuen korrelativen Licht-Elektronenmikroskopie Ansatz (CLEM) entwickelt, der mit Elektronentomographie kombiniert wird. Es war uns möglich, Spindeln die sich in X. laevis Eiextrakten geformt haben mittels HPF zu kryofixieren, was unseres Wissens nach noch niemandem vorher gelungen ist. Diese Spindeln wurden nach der Kryofixierung für eine strukturelle elektronentomographische Untersuchung aufbereitet. Wir rekonstruierten drei Viertel der Mittelzone einer meiotischen Spindel und identifizierten drei Unterkategorien von MT-Bündel Organisation. Schließlich haben wir unsere CLEM-Methode verwendet, um eine neue Technologie zu entwickeln, die in Zukunft die CLEM Arbeit erleichtern sollte. Jüngste Fortschritte in der Kunststoff-Polymer-Transformation und im Mikro-Spritzgießen (μIM), erlaubten uns eine Kryokapsel für eine einfachere korrelative Mikroskopie und einen einfacheren Transfer für HPF zu entwickeln.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Antony, Claude
Date of thesis defense: 13 December 2011
Date Deposited: 19 Dec 2011 10:47
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Cell biology , CEMOVIS , Saccharomyces cerevisiae , Xenopus laevis , electron microscopy , correlative light to electron microscopy
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