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Affinitätsbasierte chemische Transkriptomanalyse

Strauß, Benjamin

English Title: Affinity-based Chemical Transcriptome Analysis

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Abstract

Die Entdeckung von RNA-Sequenzen, die in der Lage sind, die Konzentration eines Metaboliten zu messen und abhängig davon die Genexpression zu regulieren hat Metaboliten-bindende RNAs in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses gerückt. Bisher existiert jedoch ein Mangel an experimentellen Methoden, um solche Sequenzen, die Riboswitches genannt werden, zu identifizieren. In dieser Arbeit wird mit der affinitätsbasierten chemischen Transkriptomanalyse (ABC Transkriptomanalyse) ein neuartiger, experimenteller Ansatz zur Isolierung und Identifikation unbekannter Metaboliten-bindender RNA-Sequenzen vorgestellt. Diese Methode beruht auf der Verwendung von Photoaffinitätssonden. Diese Sonden enthalten ein Metabolitanalogon, dessen spezifische Affinität zu bestimmten RNA-Aptameren eine photoreaktive Gruppe in die Nachbarschaft dieser Sequenzen dirigiert. Daraufhin können durch Bestrahlung mit UV-Licht spezifische Crosslinks erzeugt werden. Die entsprechenden Oligonukleotide können anschließend in einer Probe mit Total-RNA über eine Affinitätschromatographie angereichert werden. Für die Entwicklung von Photoaffinitätssonden, die an den bekannten Lysin-Riboswitch binden, wurde die Größe der Bindungstasche mit Hilfe säuremodifizierter Lysinanaloga sondiert. So konnte nach der Synthese dieser Moleküle und dem molekularbiologischen Nachweis ihrer Bindung an den Riboswitch das gängige Bindungsmodell erweitert werden. Für Lysinanaloga, welche durch Derivatisierung keine negative Ladung der Säurefunktion aufweisen, bleibt die Affinität zum Riboswitch erhalten, so lange der Substituent eine gewisse Größe nicht übersteigt. Mit Hilfe dieser Erkenntnisse und den Literaturdaten wurden im Folgenden drei Lysin- Photoaffinitätssonden synthetisiert, die sich bei identischer photoreaktiver Gruppe in ihrer Verknüpfung mit dem Metaboliten und ihrer Anreicherungsfunktion unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, dass die Sonden spezifisch an das Aptamer des Riboswitches binden und bei Bestrahlung mit UV-Licht einen spezifischen Crosslink ausbilden. Um mehr Erkenntnisse über Photoaffinitäts-Crosslinking zu erhalten, wurde das künstliche cAMPAptamer studiert. Bei diesem konnte mit cAMP-Photoaffinitätssonden ein hochspezifischer Crosslink generiert werden. Dadurch kann die Sequenz des Aptamers um das bis zu 33fache angereichert werden gegenüber einer Probe, in der die spezifische Bindung kompetitiv inhibiert wurde. Dieser Anreicherungsfaktor war auch in Proben mit Gesamt-RNA hinreichend stabil, so dass im Anschluss an ein Adapter-Ligations-Protokoll zur Einführung von Primer-Bindestellen mittels qPCR der Funktionsbeweis der ABC Transkriptomanalyse erbracht werden konnte. Mit dieser Methode wurde die Basis zur Isolierung und Identifikation neuer Metaboliten-bindender RNA-Motive gelegt. In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wird eine neue Methode zur RNA-Strukturanalyse durch fluoreszentes In-Line Probing gezeigt. Die Methode ermöglicht zum einen den Ersatz radioaktiver Markierungen durch Fluoreszenzfarbstoffe in In-Line Probing-Bindungsstudien an Riboswitch- Aptameren. Zum zweiten konnte gezeigt werden, dass hochmodifizierte, kleine RNAs, wie sie häufig in FRET- oder analogen biophysikalischen Studien verwendet werden, mit dieser Methode in einer Einzelnukleotidauflösung studiert werden können. Dadurch kann unter Ausnutzung der beiden bereits im Molekül befindlichen fluoreszenten Markierungen (terminal und intern) deren und der Einfluss weiterer Modifikationen auf die Struktur des Ribozyms direkt untersucht werden.

Translation of abstract (English)

The discovery of riboswitches has placed natural small-molecule-binding RNAs into the focus of scientific interest. Riboswitches regulate gene expression by sensing the concentration of a specific metabolite. However, experimental methods for the identification of new riboswitches are still lacking. In this thesis, a novel experimental approach for the isolation and identification of unknown metabolite-binding RNA sequences is presented: affinity-based chemical transcriptome analysis (ABC transcriptome analysis). The method is based on the application of photoaffinity probes. These probes contain a metabolite analog that exhibits specific affinity to an aptamer, thereby directing a photoreactive moiety into proximity of the RNA. Upon irradiation, specific crosslinks are formed and the respective oligonucleotides can be enriched from a natural RNA sample via affinity chromatography. For development of photoaffinity probes that bind to the well-known lysine riboswitch, the size of the binding pocket was probed with help of acid-modified lysine analogs. First, these analogs, which lack the negative charge at the acid functionality, were synthesized. Then, their affinity to the lysine riboswitch was tested in molecular biological experiments. Finally, the established binding model could thus be extended in such a way, that small substituents on the lysine acid functionality are tolerated by the riboswitch. In contrast to earlier reports, the negatively charged acid is not essential. Taking into account these insights and data from literature, three lysine-based photoaffinity probes with identical photoreactive groups but a different purification tag and linkage to the metabolite were synthesized. It was shown that these probes specifically bind to the riboswitch aptamer and form specific crosslinks upon irradiation with UV light. To gain better knowledge about photoaffinity crosslinking, a second system was studied using an artificial cAMP aptamer. A highly specific crosslink was generated by irradiation of an artificial cAMP aptamer in presence of cAMP photoaffinity probes. The respective sequence was enriched up to 33-fold in comparison to a sample in which the specific binding of the probes to the aptamer was competitively inhibited. This enrichment factor was sufficiently stable even in samples containing total RNA. The proof of principle for the ABC transcriptome analysis was then carried out using qPCR subsequent to an adapter ligation protocol for the introduction of primer binding sites. This method provides a base for the isolation and identification of new metabolite-binding RNA motifs. Another part of the thesis introduces a new method for RNA structure analysis by fluorescent in-line probing. This method enables the exchange of radioactive labels for fluorescent dyes in binding studies for riboswitches carried out by in-line probing. In addition, it was shown that highly modified, small RNAs, which are commonly used in FRET or similar biophysical studies, can be studied with a single-nucleotide resolution using this method. Thus, the influence of the dyes (terminal as well as internal) and other modifications on the RNA structure could directly be studied by exploiting the already present fluorescent labels.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jäschke, Prof. Dr. Andres
Date of thesis defense: 19. December 2011
Date Deposited: 12. Jan 2012 09:48
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Riboswitch , Transcriptome , Photoaffinity Crosslinking
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