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Purification of Peptides in High-Complexity Arrays

Schirwitz, Christopher

German Title: Aufreinigung von Peptiden in hochkomplexen Arrays

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Abstract

Compared to the human genome, which is formed by approximately 25,000 genes, the human proteome comprises over a million functional proteins and thus represents a much higher diversity. Although genetic research provides valuable information on the proteins which can be translated, a great task in the future will be the exploration of the entire protein interaction network. Understanding protein interactions will greatly help scientists to identify the mechanisms behind fatal diseases such as cancer, AIDS, and tuberculosis and, hopefully, provide new cures. Hence, micro arrays containing proteins or small protein fragments in the form of peptides have become of great interest in proteomic research. Using these microarrays a large number of potential target molecules can be screened for interaction with a probe in a short time frame. However, protein and peptide micro arrays are still lagging behind oligonucleotide arrays in terms of density, quality and manufacturing costs. A new approach developed at the German Cancer Research Center (DKFZ) has improved the synthesis of high density peptide arrays. The current technology is capable of producing arrays with up to 40,000 different peptides per cm² by means of a micro particle-based solid phase peptide synthesis (mpSPPS). Similar to Ronald FRANK’s SPOT synthesis, the peptides are combinatorially synthesized directly on a solid support, whereby the exact location of each peptide is known. However, the in situ synthesis bears a conceptual disadvantage: The quality of the peptides is dependent on the efficiency of the synthesis. Inefficient coupling produces peptide fragments which are present in the resulting array among the desired full length peptides. Thus, this PhD thesis dealt with the improvement of the peptide quality of in situ synthesized micro arrays. The central achievement is a new method allowing for the fast one-step purification of entire peptide arrays without loss of resolution or spatial information. The key principle is the transfer of an in situ synthesized array to a gold-coated polyvinylidenefluoride (PVDF) membrane, onto which only full-length peptides are allowed to rebind via an N-terminal cysteine. Peptides are synthesized on a solid support by means of mpSPPS using the acid-labile RINK amide (RAM) linker as an anchor group which allows for cleavage and removal of side chain protecting groups in one-step. After the synthesis, the array is brought into direct contact with the gold coated PVDF membrane. The membrane is soaked in trifluoroaceticacid (TFA) transfer medium which immediately initiates the peptide release and at the same time catalyzes a thiol-gold bond formation. Specific transfer could be verified down to a resolution of 10,000 spots per cm². Only cysteine terminated peptides which represent the full-length array members were transferred, whereas other peptides and synthesis fragments were excluded. The fluorescence signals on the target membrane appeared to be strong and almost background-free. Furthermore, no lateral diffusion was observed, which provides access to high complexity and high-quality peptide arrays in an easy manner.

Translation of abstract (German)

Im Vergleich zum menschlichen Genom, das aus etwa 25 000 Genen besteht, bietet das Proteom mit über einer Million Proteinen eine größere biologische Vielfalt. Zwar werden in der Genomforschung wertvolle Informationen gewonnen, welche Proteine bei der Translation des genetischen Codes synthetisiert werden, jedoch liegt eine noch viel größere Herausforderung in der Erforschung und Aufklärung von Protein-Interaktions-Netzwerken. Ein tiefgreifendes Verständnis solcher Protein-Interaktions-Netzwerke würde einen enormen Beitrag zur Aufklärung von Mechanismen leisten, die hinter Krankheiten wie Krebs, AIDS oder Tuberkulose stecken, und möglicherweise neue Heilmittel hervorbringen. Ein großes Interesse in der Proteomforschung gilt daher der Herstellung von Mikroarrays, die Proteine oder Protein-Bruchstücke in Form von Peptiden enthalten. Mit ihnen kann eine Vielzahl möglicher Zielmoleküle innerhalb kürzester Zeit auf Wechselwirkungen mit einer Probe untersucht werden. Da die Herstellung von Protein- und Peptid-Mikroarrays ungleich schwerer als die Synthese von Oligonukleotid-Mikroarrays ist, besteht bezüglich Auflösung, Qualität und Produktionskosten jedoch noch großer Aufholbedarf. Eine neue Methode, die am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) entwickelt wurde, hat grundlegende Probleme in der Synthese hochauflösender Peptidarrays gelöst. Mit Hilfe einer Mikropartikel-basierten Festphasenpeptidsynthese werden derzeit Peptidarrays mit Auflösungen von bis zu 40 000 verschiedenen Peptiden pro cm² produziert. Ähnlich der Spot-Synthese nach Ronald FRANK wird die Synthese nach dem kombinatorischen Prinzip direkt auf einer Trägeroberfläche durchgeführt, wobei jedes Peptid anschließend genau lokalisiert ist. Allerdings birgt das Konzept dieser in situ Synthesen einen konzeptionellen Nachteil: Die Reinheit der Peptide in einem Array hängt stark von der Syntheseeffizienz ab. Unabhängig von der Art der Aufbringung der Aminosäuren ergeben unvollständig ablaufende Kopplungen Peptidfragmente, welche mit den Peptiden im Array eingebettet sind. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde daher eine Qualitätsverbesserung für in situ synthetisierte Peptid-Mikroarrays angestrebt. Zentrale Errungenschaft ist eine neue Methode, die die schnelle Reinigung ganzer Peptidarrays in einem einzigen Schritt ermöglicht, ohne dass dabei die Auflösung oder die räumliche Information des Arrays verloren geht. Grundprinzip dieser Methode ist der Transfer eines in situ synthetisierten Arrays auf eine gold-beschichtete Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF-Membran), wobei nur vollständige Peptide über ein N terminal angebrachtes Cystein wieder binden können. Der Array wird dafür nach dem Prinzip der Mikropartikel-basierten Festphasenpeptidsynthese direkt auf einem Träger synthetisiert, welcher mit dem RINK-Amid-Linker (RAM-Linker) funktionalisiert wurde. Der RAM-Linker erlaubt eine Abspaltung der Peptide vom Trägermaterial im Zuge der Seitenketten-Entschützung. Nach erfolgter Synthese wird der Array in direkten Kontakt zu einer gold-beschichteten PVDF-Membran gebracht, welche mit einem Trifluoressigsäure-haltigen Medium getränkt wurde. Dieser Schritt leitet gleichzeitig die Seitenketten-Entschützung der Peptide, die Abspaltung vom Synthese-Träger und eine katalysierte Ausbildung von Thiol-Gold-Bindungen ein. Ein spezifischer Transfer von Peptiden konnte bis zu einer Array-Auflösung von 10 000 Peptiden pro cm² nachgewiesen werden, wobei ausschließlich vollständige Peptide mit einem N terminalen Cystein übertragen und Peptide ohne Cystein entfernt wurden. Der Fluoreszenz-Nachweis auf der Zielmembran zeigte deutliche Signale vor geringem Hintergrund, ohne dass eine merkliche laterale Diffusion der Peptide zu beobachten war. Die entwickelte Methode bietet somit einfachen Zugang zu hochkomplexen und hochqualitativen Peptidarrays.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dahint, Dr. (apl.) Reiner
Date of thesis defense: 30 March 2012
Date Deposited: 22 May 2012 15:38
Date: 2012
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: Peptidarrays , Peptidbibliotheken , Aufreinigung von Peptidarrays , Laserdrucker , Mikrochippeptide arrays , peptide libraries , peptide array purification , peptide laser printer , micro chip
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