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Alleviation of shRNA off-target effects via rAAV vector-encoded sense strand decoys

Mockenhaupt, Stefan

German Title: Minderung von shRNA off target Effekten mittels rAAV Vektor-kodierten sense Strang Inhibitoren

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Abstract

The use of exogenous triggers of RNAi such as short hairpin RNAs (shRNAs) in combination with viral vector-mediated gene delivery holds great potential for applications in gene therapy, in biotechnological processes as well as in basic research. Ideally, shRNAs only exert their activity via the antisense strand that binds and silences the designated target mRNA. However, the undesired sense strand can also be activated and hence holds a certain silencing potential. In principle, this may contribute to erratic off-targeting which typically occurs via imperfect binding and subsequent inhibition of untargeted cellular mRNAs. The aim of this study was to assess whether shRNA sense strand activity plays an important role in producing off-target effects and –if so- to find novel means of counteracting this activity. Functional characterization of relative strand activities of different shRNAs indeed revealed high levels of undesired sense strands activity for most RNAi triggers. This effect was found both upon plasmid transfection and rAAV2-mediated transduction which represents a therapeutically relevant system for gene delivery. We therefore devised a novel strategy for sense strand counteraction in which an shRNA is co-expressed with an inhibitor RNA transcript designed to stably sequester and inactivate the sense but not the antisense strand. Proof-of-concept for our approach was obtained in transfected human cells with an shRNA against hepatitis C virus (HCV). By using RNA-polymerase III-transcribed inhibitors known as tough decoys (TuDs) we could efficiently and specifically counteract the sense strand of the HCV-shRNA in luciferase and eGFP-based reporter assays. We then tested the shRNA-TuD combination in the context of a single self-complementary rAAV2 vector. TuD co-expression led to impairment of sense strand activity upon transduction of HEK293T and Huh7 cells. Inhibition of HCV replication in Huh7 cells was not altered indicating that the desired antisense strand activity was unaffected. Our strategy is hence compatible with rAAV-mediated gene delivery. Furthermore, expression profiling in Huh7 cells revealed that TuD co-expression specifically de-repressed endogenous off-target transcripts that carried seed matches to the shRNA sense strand leading to lower levels of perturbation of global gene expression. As expected, repression of transcripts carrying antisense strand seed matches remained unaffected. These results show that shRNA sense strands can indeed contribute to off-targeting and that TuD-mediated inhibition can be used to counteract this effect. Besides our functional data, we also defined rules for TuD and shRNA design as well as promoter choice which allows implementation of the system for other shRNAs. In this study, we provide new insights into the functionalities and relative activities of both strands of shRNAs. We furthermore present TuD-mediated selective counteraction of shRNA sense strands as a novel method to improve the functional strand bias and thus increase shRNA specificity. We are optimistic that our strategy will facilitate and further foster the clinical implementation of vector-based RNAi.

Translation of abstract (German)

Die Kombination aus exogenen RNAi auslösenden Molekülen wie z.B. short hairpin RNAs (shRNAs) und Gentransfer durch virale Vektoren hat ein enormes Potenzial für Anwendungen in der Gentherapie, in biotechnologischen Prozessen sowie in der Grundlagenforschung. Idealerweise sollte die Aktivität von shRNAs nur durch den antisense Strang ausgeführt werden, welcher das erwünschte zelluläre Ziel bindet und inhibiert. Prinzipiell kann jedoch auch dem unerwünschten sense Strang eine gewisse Inhibierungsaktivität innewohnen. Dies kann zu unerwünschten off-target Effekten von shRNAs beitragen, welche normalerweise durch imperfekte Bindung und anschließende Inhibierung von nicht anvisierten zellulären mRNAs auftreten. Die vorliegende Studie sollte zunächst herausfinden, ob shRNA sense Strang Aktivität zu nennenswerten off-target Effekten führen kann. Falls zutreffend, sollten desweiteren neue Ansätze entwickelt werden, um diese Aktivität zu verringern. Die funktionale Charakterisierung der relativen Strangaktivität verschiedener shRNAs offenbarte, dass die sense Stränge in den meisten Fällen tatsächlich eine hohe Aktivität aufweisen. Dies wurde sowohl nach Plasmidtransfektion als auch nach Transduktion durch AAV Vektoren, welche ein relevantes System für den therapeutischen Gentransfer darstellen, beobachtet. Aus diesem Grund entwickelten wir eine neue Strategie, in der shRNAs gemeinsam mit einer Inhibitor-RNA exprimiert werden, welche den unerwünschten sense-Strang, nicht jedoch den erwünschten antisense Strand der shRNA dauerhaft bindet und inaktiviert. Unser Ansatz wurde in transfizierten humanen Zellen mit einer vorher beschriebenen shRNA gegen Hepatitis C Virus (HCV) getestet. Mit Hilfe von RNA-Polymerase III-transkribierten Inhibitor Molekülen, die als tough decoys (TuDs) bekannt sind, konnten der sense Strang Aktivität der HCV shRNA effizient entgegengewirkt werden. Als nächstes wurde die Kombination aus shRNA und TuD im Kontext von selbst-komplementären rAAV2 Vektoren getestet. Wir konnten beobachten, dass Ko-Expression des TuDs nach Transduktion von HEK293T und Huh7 Zellen zu einer starken Beeinträchtigung der sense Strang Aktivität führte. Die Inhibition der HCV Replikation in Huh7 Zellen war jedoch unverändert, was auf einer unveränderte Aktivität des erwünschten antisense Stranges schließen lässt. Dies bedeutet, dass unsere Strategie mit dem Gentranfer durch AAV Vektoren kompatibel ist. Eine Analyse der Genexpression in Huh7 Zellen offenbarte desweiteren, dass durch die Ko-expression des TuD endogene off-target Transkripte, welche komplemetäre Sequenzen zur seed Sequenz des shRNA sense Stranges trugen, spezifisch de-reprimiert wurden. Dies hatte auch eine geringere globale Deregulierung der Genexpression durch die shRNA zur Folge. Wie erwartet war die Repression von Transkripten mit komplementären Sequenzen zur seed Sequenz des antisense Stranges unverändert. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass der sense Strang von shRNAs tatsächlich zu off-target Effekten beitragen und dass diesen durch Ko-Expression von TuDs entgegengewirkt werden kann. Zusätzlich zu den funktionalen Daten wurden Richtlinien für das Design von shRNA und TuD sowie für die Wahl des Promotors bestimmt, wodurch eine Übertragung des Systems auf andere shRNAs ermöglicht wird. Diese Studie liefert neue Einblicke in die Funktionalität und die relativen Aktivitäten beider Stränge von shRNAs. Desweiteren wird die selektive Inhibition von shRNA sense Strängen durch TuDs als neue Methode zur Erhöhung von shRNA Spezifitäten vorgestellt. Diese Methode könnte zur zukünftigen klinischen Einführung von vektorbasierten RNAi Therapien beitragen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bartenschlager, Prof. Dr. Ralf
Date of thesis defense: 24 May 2012
Date Deposited: 29 May 2012 15:29
Date: 2012
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Non-coding RNA, Gentherapie, Hepatitis-C-Virus, Dependoviren
Uncontrolled Keywords: Virale Vektoren , shRNAViral vectors , shRNA , gene therapy , hepatitis C virus
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