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Functional roles of bone morphogenetic protein-9 in liver pathology

Li, Qi

German Title: Funktionelle Rolle von Knochenmorphogenetischem Protein-9 der Leberpathologie

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Abstract

Bone Morphogenetic Protein (BMP)-9 gehört zur Familie der Transforming Growth Factor (TGF)-beta Zytokine welche als Modulatoren zentraler, zellulärer Prozesse, wie Osteogenese, Hämatopoese, Glukosehomeostase, Eisenhaushalt, Angiogenese sowie Tumorgenese beschrieben wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Expressionslevel von BMP-9 in Mäuselebern nach akuter Schädigung der Leber durch einmalige CCl4 Injektion untersucht. Es zeigte sich insbesondere in perivenösen Arealen der Leber eine schnelle Induktion der BMP-9 Expression, welche an Tag 3 ihr Maximum erreichte. Bereits 3 h nach CCl4 Applikation konnte mittels Western blot und Immunfärbungen gegen phosphoryliertes Smad1 eine starke Aktivierung des BMP-9 Signalweges gezeigt werden, die bis mindestens Tag 3 erhöht blieb. Außer in Hepatozyten fand sich diese Smad1 Aktivierung auch in sinusoidalen Zelltypen. An Tag 3 waren auch Zellen positiv gefärbt, bei welchen es sich vermutlich um aktivierte hepatische Sternzellen (HSC) handelt. Immunfärbungen gegen alpha-smooth muscle actin (SMA), Desmin und aktivierte Caspase-3 deuten stark darauf hin, dass an Tag 3 nach CCl4 Injektion HSC im perivenösen Bereich aktiviert sind und proliferieren sowie dass Hepatozyten (HC) dann vermehrt in Apoptose gehen. In Zellkulturexperimenten konnte gezeigt werden, dass BMP-9 bei der Aktivierung primärer Maus-HSC eine Rolle spielt und dass es die TGF-beta vermittelte Apoptose in primären Maus-HC verstärkt. In Gewebeschnitten von Patienten mit hepatozellulärem Karzinom (HCC) fand sich in 25/41 (61%) Patienten eine leicht positive Immunfärbung für BMP-9 ("1+"), und in 16/41 (39%) eine stark positive Färbung ("2+"). In 27/41 (65.85%) konnte darüber hinaus mittels in situ Hybridisierung eine Korrelation zwischen BMP-9 Protein- und mRNA-Ebene nachgewiesen werden. Des Weiteren korrelierte eine positive phospho-Smad1 Färbung mit erhöhter BMP-9 Expression ("2+" Proteinebene). Tendenziell ging die BMP-9 Expression mit erhöhter Expression von Snail und verminderter Expression von E-Cadherin einher, diese Korrelation erreichte jedoch keine Signifikanz. Schließlich konnte eine signifikante Korrelation der BMP-9 Expression mit der Invasivität der Tumoren nachgewiesen werden. BMP-9 Stimulation von HCC Zellen in vitro induzierte die Expressionen von Vimentin und Snail und reduzierte die von E-Cadherin, ein Expressionsmuster, das charakteristisch für eine epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist. In Korrelation zu diesen Befunden verstärkte BMP-9 auch die in vitro Migration von HCC Zellen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass BMP-9 nach Leberschädigung eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von HSC und der TGF-β vermittelten Apoptose von Hepatozyten spielt und daß es über Induktion von EMT pro-tumorigene Effekte beim HCC ausübt.

Translation of abstract (English)

Bone morphogenetic protein (BMP)-9 belongs to the transforming growth factor (TGF)-beta superfamily and has been suggested to play a role in bone formation, hematopoiesis, glucose homeostasis, iron homeostasis, angiogenesis and cancer development. Using the acute carbon tetrachloride (CCl4) mouse model for liver injury we found that BMP-9 expression increased rapidly, reaching a maximum at day 3 after injection of CCl4. At this time-point, positive BMP-9 staining was mainly localized to the pericentral area, where hepatocytes were seriously damaged. Phosphorylation of Smad1, one of the main BMP’s transducing signaling molecules, was increased mainly in hepatocytes already at 3 h after CCl4 application, although some positive staining for pSmad1 was also observed in sinusoidal cells. At day 3, positivity was additionally detected in infiltrating cells, representing most likely proliferating, activated hepatic stellate cells (HSCs). Immunostainings for alpha-smooth muscle actin (SMA), desmin and cleaved caspase3 showed that at day 3, in pericentral areas the extent of hepatocyte apoptosis reached its peak and HSCs significantly proliferated and activated. Even though in vitro BMP-9 did not cause apoptosis directly, it enhanced TGF-beta1-induced hepatocyte apoptosis. In vitro experiments demonstrated that BMP-9/Smad1 signaling was involved in the transdifferentiation of HSCs. In human hepatocellular carcinoma (HCC) samples, mildly positive (1+) BMP-9 immunostaining was observed in 25/41 (61%), and moderately to strongly positive staining (2+) was observed in 16/41 (39%) patients. In 27/41 (65.85%) patients, BMP-9 protein expression levels were consistent with the mRNA expression level as measured by in situ hybridization. In those patients with 2+ protein levels, nuclear pSmad1 expression in cancer cells was also significantly increased. BMP-9 expression was positively correlated to nuclear Snail expression and reversely correlated to cell surface E-cadherin expression, although this trend did not reach statistical significance. Expression levels of BMP-9 were significantly correlated with the T stages of the tumors, which is a measure for the degree of tumor invasion. In vitro in HCC cells, similar to the findings with human samples, BMP-9 treatment caused a reduction of E-cadherin and an induction of Vimentin and Snail expression, which are characteristics of epithelial-mesenchymal transition (EMT). Furthermore, BMP-9 enhanced cell migration. In conclusion, these results imply that BMP-9 is involved in HSC activation and hepatocyte apoptosis during liver damage and regeneration, and that it acts as a tumor promoter via inducing EMT in HCC.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wölfl, Prof. Dr. Stefan
Date of thesis defense: 26 July 2012
Date Deposited: 01 Aug 2012 11:30
Date: 2012
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Medizinische Klinik - Lehrstuhl für Innere Medizin II
The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: liver damage , BMP-9 , HCC , Smad1
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