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Function of Synapsin Proteins in Synaptic Transmission at a Giant CNS Synapse

Vasileva, Mariya

German Title: Funktion der Synapsin Proteine während Synaptischer Transmission an Risieger ZNS Synapse

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Abstract

At chemical synapses synaptic vesicles are functionally segregated into distinct pools depending on their mobility and release probability in response to action potentials. At most synapses synapsin proteins cluster and immobilize reserve pool vesicles within the cytoskeletal network, distally from the active zones. Activity-dependent phosphorylation of synapsins releases synaptic vesicles from the complex meshwork of the cytoskeletal components and renders them freely mobile and able to undergo vesicle cycling. There are three synapsin genes in mammals and their alternative splicing results in more than ten isoforms whose functional differences in maintaining synaptic transmission are not fully elucidated. In this study we examined the involvement of synapsins in synaptic transmission using two independent approaches. First, we established the structure-function relationship at synapses, overexpressing synapsin I isoforms (synapsin Ia or synapsin Ib). Second, synaptic transmission and structural integrity of synapses in mice, lacking all three synapsin genes (triple knock-out (TKO)) were examined. The calyx of Held, a giant glutamatergic synapse located in the auditory brain stem, was utilized as a model system. Synapsin I isoforms overexpression was accomplished through transduction of globular bushy cells (GBCs), located in the ventral cochlear nucleus, with recombinant adeno- associated viral particles. The GBCs are projection neurons, which give rise to the calyx of Held in the medial nucleus of the trapezoid body. 10 days after the transduction, overexpression of synapsin I isoforms resulted in a redistribution of SV within the calyx of Held, without changing the size and the overall structure of the perturbed synapses. Ultrastructural analysis, using serial sectioning scanning electron microscopy (S3EM) revealed that synapsin Ia overexpression resulted in decreased numbers of SVs at the active zone without altering the total vesicle number. Therefore, we could conclude that synapsin Ia overexpression was followed by vesicle redistribution within the presynaptic terminal. On the functional level, the overexpression of both synapsin I isoforms had no effect on the properties of spontaneous and evoked EPSCs. However, repeated stimulation at frequencies exceeding 10 Hz led to accelerated short-term depression (STD). Overexpression of either isofroms led also to accelerated recovery from depression after strong stimulation. Brain lysates from synapsin TKO mice revealed a strong reduction in the level of several synaptic vesicle proteins, while proteins of the active zone cytomatrix or of the postsynaptic density remained unaffected. Accordingly, TKO calyces had lower amounts of vGluT1 immunoreactivity while the level of the active zone marker bassoon was unchanged Summary i as shown via 3D reconstructions of TKO calyces. The S3EM analysis confirmed these results revealing a 50 % reduction in the number of synaptic vesicles in TKO calyces. The structural alterations resulting in the absence of synapsins led to accelerated and more pronounced STD at stimulation at frequencies above 100 Hz. Synapsin deletion, contrary to synapsin overexpression, slowed down the recovery of depression. This might prove that synapsin- dependent SVs contribute to the faster replenishment of the readily releasable pool, which maintains synaptic transmission under basic conditions. Despite the structural defects and the alterations in the short-term depression, transmission failures were not observed during the high-frequency trains. These results reveal that in wild-type synapses the synapsin-dependent vesicles account only for a small fraction of the SVs that enter the RRP. In conclusion, synapsins maintain of a specific vesicle population at CNS synapses. However, these vesicles are dispensable from normal basal synaptic transmission and are recruited only when the synapse is exposed to long-lasting high-frequency activity. The synapsin-dependent vesicles are fed into the readily releasable pool to counteract the effects of presynaptic depression and aid the faster recovery of the synapse. Although synapsins may be required for normal synaptic vesicle biogenesis, trafficking and immobilization, they are not essential for sustained synaptic transmission at the calyx of Held.

Translation of abstract (German)

An chemischen Synapsen, werden synaptische Vesikel an Hand ihrer Mobilität und Freisetzungswahrscheinlichkeit verschiedenen funktionellen Pools zugeordnet. Die synaptischen Vesikel des Reservepools werden in den meisten Synapsen durch Synapsine an das Zytoskelett in Regionen entfernt von den aktiven Zonen gebunden. Synapsine können in Abhängigkeit von synaptischer Aktivität phosphoryliert werden, was zu einer Loslösung der Vesikel vom Zytoskelett führt. Die dann freibeweglichen Vesikel können am synaptischen Vesikelzyklus teilnehmen. In Säugern existieren drei Synapsingene die alternativ gespleißt werden, was zu mehr als zehn verschiedenen Isoformen führt. Die funktionellen Unterschiede der verschiedenen Isoformen bei der Regulation der synaptischen Transmission sind bis jetzt nur unzureichend verstanden. Die funktionellen Eigenschaften der Synapsine wurden in der vorliegenden Arbeit in zwei verschiedenen Ansätzen untersucht. Zum einem wurden Struktur und Funktion von Synapsen untersucht in denen eine Synapsin-I-Isoform (Synapsin Ia oder Synapsin Ib) überexprimiert wurde, zum anderen die synaptische Transmission und die strukturelle Integrität von Synapsen bei denen alle drei Synapsingene ausgeschaltet wurden (triple knock- out (TKO)). Als Modelsynapse für beide Ansätze diente der Held’sche Calyx, eine glutamaterge Riesensynapse im auditorischen Hirnstamm. Eine Überexpression von Synapsin-I-Isoformen wurde durch Transduktion von globular bushy cells (GBCs) im ventralen choclearen Nucleus mit rekombinanten adeno- assoziierten viralen Partikel erreicht. GBCs sind Projektionsneurone die im medialen Kern des kontralateralen Trapezkörpers die Held’schen Calyces bilden. Zehn Tage nach der Transduktion führte die Überexpression zu einer Umverteilung der synaptischen Vesikel innerhalb des Held’schen Calyx, dessen allgemeine Struktur nicht verändert wurde. Die ultrastrukturelle Analyse mittels serial sectioning scanning Elektronenmikroskopie (S3EM) ergab dass weniger synaptische Vesikel in unmittelbarer Nähe zur aktiven Zone vorhanden waren. Da die Gesamtanzahl der synaptischen Vesikel nicht verändert war, ergab sich also eine Umverteilung der Vesikel bei Synapsin I Überexpression. Auf der funktionellen Ebene hatte die Überexpression von Synapsin I keinen Effekt auf spontane oder aktionspotentialabhängige Vesikelfreisetzung. Lediglich bei wiederholter Stimulation mit mehr als 10 Hz wurde eine beschleunigte Kurzzeitermüdung beobachtet. Die Erholung von dieser Ermüdung wurde allerdings auch durch beide Synapsin I Isoformen beschleunigt. Bei der Untersuchung der Gehirne von TKO-Mäusen wurde eine starke Reduktion mehrer vesikulärer Proteine festgestellt, während Proteine der aktiven Zone und der Summary iii postsynaptischen Dichte nicht betroffen waren. Dementsprechend wiesen auf Immunfluoreszenz basierende 3D Rekonstruktionen von TKO-Calyces reduzierte Mengen des synaptischen Proteins vGluT1 aber nicht des aktiven Zonen-Markers Bassoon auf. Die ultrastrukturelle Analyse mittels S3EM bestätigte diese Befunde, da TKO-Calyces eine um 50% reduzierte Anzahl von synaptischen Vesikeln aufwiesen. Diese strukturellen Veränderungen in der Abwesenheit von Synapsinen resultierten in einer beschleunigten und ausgeprägteren Kurzzeitermüdung bei Stimulationsfrequenzen über 100 Hz. Die Erholung von der Kurzzeitermüdung war, im Gegensatz zu Calyces die Synapsin I überexprimieren, in TKO-Calyces verlangsamt. Dies lässt vermuten, dass die Synapsin-abhängigen Vesikel zum schnellen Auffüllen des readily-releasable Pools, der die Vesikel zur Aufrechterhaltung der synaptischen Transmission stellt, beitragen. Trotz der strukturellen Defekte und der veränderten Kurzzeitermüdung wurde auch bei hohen Stimulationsfrequenzen kein Versagen der synaptischen Transmission beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Anteil der Synapsin-abhängigen synaptischen Vesikel am readily-releasable Pool begrenzt ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Synapsine für die Aufrechterhaltung einer spezifischen Vesikelpopulation an ZNS Synapsen nötig sind. Diese Vesikel sind allerdings während normaler synaptischer Transmission entbehrlich und werden erst bei dauerhafter, hochfrequenter Aktivität rekrutiert. Eine Erweiterung des readily-releasable Pools um diese Vesikelpopulation minimiert die präsynaptische Kurzzeitermüdung da mehr Vesikel zur Verfügung stehen die zur Erholung beitragen können. Trotz eine eindeutige Beteiligung der Synapsine an der normalen Biogenese der synaptischen Vesikel, deren Transport und Immobilization sind Synapsine nicht notwendig um eine hochfrequente, anhaltende und verlässliche synaptische Transmission im Held’schen Calyx zu gewährleisten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kuner, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 24. July 2012
Date Deposited: 16. Aug 2012 12:07
Date: 2012
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Dekanat der Medizinischen Fakultät Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: synapse, synaptic transmission, synaptic vesicle, active zone, presynaptic depression
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