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Mechanisms of CD95-Clustering

Berndt, Johanna

German Title: Mechanismen des Clustering des CD95-Rezeptors

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Abstract

In this study I investigated the mechanisms of clustering of the apoptosis receptor CD95 after induction with its ligand and the oligomerization level before induction. Previous studies demonstrated that receptor clustering is an essential part in apoptosis signaling. Mostly using biochemical methods and nuclear magnetic resonance the essential role of various mechanisms in receptor clustering could be shown, such as lipid raft localization of the receptor, clustering via the receptor death domain and internalization. An oligomerization of receptors before induction via a so called pre-ligand assembly domain could be shown at high concentrations, so that typically the receptor is assumed to be trimeric before induction. Moreover a consistent model of the role of all mechanisms in different cell types and direct observation on the plasma membrane is still missing. Therefore I investigated receptor clustering in single living cells on the cell membrane using microscopy. In particular I quantified intensities to correlate with the number of molecules. and studied receptor clustering by dynamics measurements using fluorescence recovery after photobleaching. I observed that receptor clustering is concentration dependent and in HeLa at high receptor concentrations the ligand as only crosslinking mechanism yields mean clusters size of seven molecules. Death domain assembly and lipid raft localization do not effect clustering in this cell type. At physiological expression levels the pre-ligand assembly shows an oligomer distribution with an eminent part of monomers or dimers. By knockdown of the receptor the distribution can be pushed to monomers. I made a consistent study for the type II cell line HeLa, considering many proposed clustering mechanisms and showed that ligand binding alone is a strong mechanism that can lead to high levels of clustering. I propose a model where the receptor is present as monomers or dimers at physiological concentrations in the absence of induction.

Translation of abstract (German)

In dieser Arbeit habe ich den Clusterungs-Mechanismus des CD95 Rezeptors nach Ligandinduktion und der Oligomerisationsstatus vor Induktion untersucht. Bisherige Studien zeigten, dass Clustern von Rezeptoren einen wesentlichen Teil im Apoptose-Signalweg darstellt. Mit hauptsachlich biochemischen Methoden und Kernspinresonanz wurde der Einfluss von verschiedenen Mechanismen auf ein Clustern des Rezeptors erforscht, insbesondere eine Anordnung des Rezeptors in Lipid Rafts, Internalisierung und Bindung über eine Domäne des Rezeptors namens ”death domain”. Ebenfalls biochemische Methoden konnten eine Bindung zwischen Rezeptoren vor Induktion über die so genannte Pre-Ligand-Assembly-Domäne (PLAD) aufdecken, so dass momentan das Modell eines Rezeptortrimers weit verbreitet ist. Zudem fehlt ein einheitliches Model zur Beschreibung aller Cluster-Mechanismen in unterschiedlichen Zellen ebenso wie Messungen direkt auf der Zellmembran. Daher habe ich das Rezeptor-Clustern auf der Zellmembran von lebenden Zellen mit Mikroskopiemethoden untersucht. Insbesondere wurden Intensitäten quantifiziert um Molekülanzahlen pro Cluster zu ermitteln desweiteren wurden Aggregation mit Diffusionsbestimmung mit Bleichexperimenten gemessen. Ich habe festgestellt, dass das Clustern von Rezeptors von der Rezeptorkonzentration abhängt. In HeLa-Zellen führt die Vernetzung durch den Liganden, als alleiniger Mechanismus zu Clustergrößen von sieben Molekülen. Die Verbindung der death domains und Lipid Raft Lokalisierung wurden als Aggregationsmechanismen in diesem Zelltyp ausgeschlossen. Bei physiologischen Rezeptorkonzentrationen vor Induktion folgt der Rezeptor einer Anzahlverteilung mit einem erheblichen Anteil an Monomeren oder Dimeren. In Zellen mit künstlich verringerter Rezeptorexpression konnte die Verteilung hin zu Monomeren verschoben werden. Ich habe eine einheitliche Untersuchung der HeLa Zelllinie des Types II angestellt unter Betrachtung aller vorgeschlagenen Cluster-Mechanismen und habe gezeigt, dass Ligandeninduktion als einziger Mechanismus zu großen Rezeptoraggregationen führen kann. Für physiologische Konzentrationen ohne Induktion ist das Modell eines Rezeptors anzu-nehmen, der hauptsächlich mono- und dimerisch vorliegt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof. Dr. Roland
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 22. October 2012
Date Deposited: 07. Dec 2012 06:38
Date: 2012
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
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