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Abstract

Rhabdomyosarkome (RMS) sind die häufigsten Weichgewebetumoren bei Kindern und Jugendlichen. Obwohl die 5-Jahres-Überlebensrate bei lokalisierten RMS heute 70% erreicht, ist die Überlebensrate bei metastasierten RMS gering. Diesen Risikopatienten eröffnen sich neue Perspektiven durch immuntherapeutische Strategien. Die Entwicklung des adoptiven Transfers RMS-reaktiver chimärer T Zellen steht im Zentrum der vorliegenden Arbeit. In Voruntersuchungen wurden chimäre Antigenrezeptoren (CAR) mit Spezifität für ein RMS spezifisches Antigen, den fetalen Acetylcholinrezeptor (fAChR), generiert. Die retrovirale Expression dieses CAR auf der Oberfläche von Blutlymphozyten erzeugt chimäre T Zellen, die fAChR-exprimierende RMS-Zellen in vitro und in vivo erkennen. CAR der ersten Generation, die aus dem scFv-Fragment eines humanen fAChR spezifischen Autoantikörpers, einer IgG und einer CD3ζ Domäne bestehen, erzeugen in chimären T Zellen jedoch eine zu geringe zytolytische Aktivität, um ihren Einsatz in vivo zu rechtfertigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher der CAR der ersten Generation mit einer zusätzlichen CD28 Signaldomäne ausgestattet, um fehlende kostimulatorische Signale zu kompensieren und die Anergisierung chimärer Zellen zu verhindern. Diese Rezeptor-Modifikation steigerte die lytische Aktivität der chimären Zellen signifikant, blieb jedoch im Vergleich zu CEA spezifischen CAR bei Colon Karzinomzellen unbefriedigend. Die anschließende Analyse potenzieller Resistenzmechanismen zeigte, dass essentielle kostimulatorische Oberflächenmoleküle auf RMS fehlen, während Inhibitoren der Tumor T Zell Interaktion, wie B7H1 und B7H3, von RMS verstärkt exprimiert werden. Des Weiteren erwies sich die Expression von Adhäsionsmolekülen für die Effektivität chimärer Effektorzellen als relevant, da die CD54-Neoexpression auf mehreren primär CD54 negativen RMS Zelllinien die Zytotoxizität chimärer T und CIK Zellen in vitro signifikant steigerte. Als Weitere, teilweise RMS-Zelllinien-spezifische, potenzielle Resistenzmechanismen wurden stark verminderte Sensitivitäten gegenüber IFNγ, TNF, FAS-L und teilweise TRAIL gefunden. Außerdem zeigten RMS-Zelllinien und RMS-Gewebe eine starke Überexpression von Mitgliedern der inhibitor of apoptosis (IAP) Familie, die in die T-Zell-induzierte Apoptose eingreifen. Die siRNA vermittelte oder pharmakologische Hemmung von überexprimierten IAPs verbesserte die Zytotoxiziät chimärer T Zellen gegenüber RMS-Zellen signifikant. Erste Versuche mit immundefizienten NOD/SCID Mäusen zeigten, dass die einmalige Gabe fAChR reaktiver chimärer T Zellen das Wachstum von RMS Xenotransplantaten verlangsamen, die Tumorzellen aber nicht eradizieren konnte. Zukünftige In-vivo-Experimente haben daher das Ziel, die Ausschaltung der neu entdeckten Resistenzmechanismen mit der wiederholten Gabe verbesserter chimärer T Zellen zu verbinden, um die Effizienz des adoptiven Transfers RMS-spezifischer chimärer T-Zellen zu steigern.

Translation of abstract (English)

Rhabdomyosarcoma is the most common soft tissue malignancy of childhood and adolescence. Despite improved 5-year overall survival rates that now reach 70% in patients with localized tumours, outcome of children with advanced RMS is still poor. Immune therapeutic options offer new perspectives for high-risk patients. Design of an adoptive immune therapy using RMS specific chimeric T cells was the objective of this work. To explore an immune cell anti-tumour approach, we redirected cytotoxic T cells towards RMS cells by a chimeric antigen receptor (CAR) with specificity for the foetal acetylcholine receptor (fAChR), which is a specific tumour associated antigen expressed on RMS. These chimeric T cells should be able to recognize and kill fAChR+ RMS cells in vitro and in vivo. However, chimeric T cells expressing a previously generated CAR, consisting of a scFv fragment (made from an fAChR specific antibody), an IgG hinge region and a CD3ζ signal transduction domain, showed attenuated killing, which appeared insufficient for in vivo use. In this work we generated an improved chimeric receptor by adding a costimulatory CD28 domain to compensate for missing costimulatory signals and avoid induction of T cell angergy. Chimeric T cells expressing the modified CAR showed enhanced RMS tumour cell lysis, but were markedly attenuated in comparison to killing of CEA expressing colon carcinoma by CEA-specific chimeric T cells. Analysis of costimulatory and immunosuppressive surface molecules, crucial factors of tumour cell-T cell interaction, revealed failure of RMS to express essential costimulators; instead, expression of inhibitory molecules, like B7H1 and B7H3, was observed. It was also shown that adhesion molecules influence the effect of chimeric T cells: induced over-expression of the adhesion molecule CD54 by RMS cells strongly increased their susceptibility to chimeric T cells and CIK cells. We found also a reduced sensitivity of RMS against IFNγ, TNF, FAS-L and partially TRAIL, which are potential cell line-specific resistance mechanisms. Of particular interest was the strong over-expression of inhibitor of apoptosis (IAP) family members in RMS cells and tissue, since IAPs interfere with T cell mediated apoptosis induction. Consequently, inhibition of IAPs through specific siRNA or pharmacological substances improved killing efficiency by chimeric T cells. Treatment of RMS bearing NOD/SCID mice with fAChR specific chimeric T cells revealed delayed tumour development but no definitive eradication. Future in vivo experiments want to combine blockade of the discovered resistance mechanisms in RMS with application of improved chimeric T cells, to develop new therapeutic options for RMS patients.