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Effects of c-Myc overexpression in osteoblasts on bone homeostasis, sarcoma formation and dormant hematopoietic stem cell maintenance

Brückmann, Ines

German Title: Auswirkungen der c-Myc Überexpression in Osteoblasten auf die Knochenhomöostase, Sarkomentstehung und die Erhaltung ruhender, hämatopoietischer Stammzellen

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Abstract

The transcription factor c-Myc is an important proto-oncogene and its expression is induced by a variety of mitogenic signals promoting cell proliferation, cell growth and stem cell maintenance while concomitantely inhibiting terminal differentiation. In order to elucidate the role of c-Myc in the HSC niche, a doxycycline-inducible double transgenic ColtTA;TreMyc mouse model was used to conditionally overexpress human c-Myc in endosteal niche osteoblasts (mutant; mt). These mice display developmental bone disorders with signs of osteopetrosis. The animals developed thicker bones with concomitantly increased amounts of osteoblasts and osteoclasts. In addition the structure of the compact bone compartment was interrupted with cavernal structures, filled with ectopic bone marrow. qPCR analysis revealed that the expression of the cell cycle inhibitor p57KIP2 was significantly lower in mutant osteoblasts, suggesting that c-Myc dependent down-regulation of the cell cylce inhibitor induced elevated cell proliferation of mutant osteoblasts resulting in a higher bone-turnover. Most strikingly, the elevated bone remodeling caused a fast reduction of dormant hematopoietic stem cells (dHSCs), known to harbor the most potent HSCs. BrdU-label retaining assays revealed similar turnover kinetics for dormant and homeostatic HSCs, both dividing every 58 days in mutant animals. These data suggest that dHSC are not maintained in mutant animals. Besides decreased numbers in dHSCs a simultaneous decrease of long- and short-term HSCs (LT-, ST-HSCs) was observed, while the number of more differentiated progenitor and mature cells did not differ between mutant and control mice. Interestingly, dHSC loss appeared to be compensated by elevated Bmi1 expression and down-regulated p16INK4a cell cycle inhibitor in cycling LT-HSCs in order to prevent their premature depletion. Interestingly, HSC differentiation capacity in mutant mice was not impaired and the bone marrow reconstitution ability of mutant HSCs after bone marrow transplantation was also normal. Notably, the proportion of LT- and ST-HSCs was significantly decreased in recipients of primary and secondary bone marrow transplantations, indicating that only the number but not self-renewal and differentiation capacities of HSCs were reduced in c-Myc overexpressing mice. Interestingly, unlike wild type HSCs, HSCs from double transgenic animals could not be efficiently activated by the HSC activators dsRNA PolyI:C or lipopolysaccharide (LPS).

Strikingly, 26% of transgenic ColtTA;TreMyc animals developed osteosarcoma often associated with simultaneous lung and liver metastasis. Analysis of osteoblasts from tumor bearing mice revealed high similarities to human osteosarcoma, with the tumor osteoblasts displaying an immature osteoblastic phenotype with deregulated Wnt signaling and high expression of the tyrosine kinase receptor c-kit. Interestingly it was recently shown that c-kit is expressed in human osteosarcomas and that its expression negatively correlates with patient survival. Thus this mouse model system might be an interesting tool for further pre-clinical studies, as it is the first osteosarcoma model with spontaneous tumor development closely resembling human osteoblastic osteosarcoma. Finally, our model highlights the important cross-talk between endosteal osteoblasts, hematopoietic stem cells and tumorigenesis, which are also found deregulated in a variety of human bone marrow diseases. The mouse model generated and characterized in this work may facilitate to elucidate the complex molecular and cellular mechanisms operative in the diseased organism and may be used to the development of novel intervention strategies.

Translation of abstract (German)

Eines der wichtigsten Proto-onkogene im Menschen ist der Transkriptionsfaktor c-Myc. Die Expression von c-Myc wird durch eine Vielzahl mitogener Signale induziert und spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Zellteilung, Wachstum, terminaler Differenzierung und Stammzellerhaltung. Die genaue Funktion des Transkriptionsfaktors hängt dabei stark vom jeweiligen Zelltyp ab. Um die Funktion von c-Myc in ausgereiften Osteoblasten im Knochen genauer beschreiben zu können, verwendeten wir das transgene Mausmodell ColtTA;TreMyc (Mutante; mt), in dem die Expression von humanem c-Myc über den Collagen I Promotor reguliert wird. Durch die Überexpression von c-Myc kam es zunächst zu schweren Entwicklungsstörungen des Knochens mit Anzeichen von Osteopetrose, d.h. sichtbar verdickten Knochen mit einem erhöhten Anteil an Osteoblasten und Osteoklasten. Die kompakte Hartsubstanz der Knochen war jedoch völlig mit Knochenmarkeinschlüssen durchzogen und führte zur Erhöhung der Knochenbrüchigkeit. Verstärktes Ostenblastenwachstum und erhöhte Umbaufrequenz sind wahrscheinlich Folge der verminderten Expression des Zellzyklus-Inhibitors p57KIP2. Interessanterweise führte diese verstärkte Knochenumstrukturierung zu einer drastischen Abnahme der potentesten Stammzellpopulation des hämatopoetischen Systems, der sogenannten ruhenden Stammzellen (dormant, dHSCs). Analyse der Zellteilungsrate zeigte, dass sich aktivierte und ruhende Stammzellen in den mutanten Mäusen im Schnitt nach 58 Tagen teilen, d.h dass im transgenen Mausmodell keine ruhenden Stammzellen mehr vorhanden sind. Dieser Verlust der dHSC Population ging mit einer erhöhten Expression von Bmi1 und gleichzeitiger Herunterregulierung des Zellzyklus-Inhibitors p16INK4a in LT-HSCs einher. Möglicherweise um so den stetigen Verlust der Zellen nach erneuter Zellteilung zu verhindern. Zusätzlich sind weniger homeostatische Stammzellen (LT-, ST-HSC) vorhanden, die sich auch nach Knochenmarkstransplantationen der HSCs in immunkomprimierte Mäuse widerspiegelte. Wohingegen keine Unterschiede in der terminalen Differenzierung vorlagen. Dies zeigt, dass allein die Anzahl der HSCs, jedoch nicht ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierungsfähigkeiten in den transgenen ColtTA;TreMyc Mäusen beeinträchtigt waren. HSCs können in Stresssituationen wie bakteriellen oder viralen Infektionen schnell aktiviert werden, teilweise durch das Zytokin IFNα. Interessanterweise konnten Stammzellen von transgenen Mäusen weder durch die Injektion der dsRNA Poly-I:C, welches zur Produktion von IFNα führt, noch durch LPS Injektion aktiviert werden.

Zusätzlich entwickelten sich in 26% der transgenen Tiere Osteosarkome, die in Lunge und Leber metastasierten, und eine große Ähnlichkeit zu humanen Osteosarkomen aufwiesen. Insbesondere waren die Tumor-Osteoblasten genau wie in humanen Osteosarkomen undifferenziert und zeigten einige Eigenschaften unreifer Osteoblasten, sowie eine Deregulierung des Wnt-Signalweges und erhöhte Expression des Tyrosin Kinase-Rezeptors c-Kit. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass in humanen Osteosarkomen ein Zusammenhang zwischen c-Kit Expression und der Überlebensdauer der Patienten besteht. Zusammengefasst handelt es sich bei dem vorliegenden Maus-Modell um das erste Osteosarkom-Modell, in dem Tumore wie beim Patienten spontan entstehen. Es eignet sich daher gut als Testmodell zur Erforschung neuer Tumor-Therapien gegen Osteosarkome. Darüber hinaus ermöglicht das Mausmodell die genauere Analyse der hämatopoetischen Stammzell-Nische und der Interaktion zwischen Osteoblasten und HSCs, die in einer Vielzahl von humanen Erkrankungen gestört ist. Dadurch können Regulationsmechanismen und Krankheitsentstehung besser untersucht und moduliert werden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Trumpp, Prof. Dr. Andreas
Date of thesis defense: 22 November 2012
Date Deposited: 18 Dec 2012 13:29
Date: 22 November 2012
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Myc, Osteoblast, Blutstammzelle
Uncontrolled Keywords: dormant hematopoietic stem cells, stem cell niche, osteosarcoma
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