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Structural and functional studies on the human DEAD-box helicase DDX1

Kellner, Julian

German Title: Strukturelle und funktionelle Studien an der menschlichen DEAD-box Helikase namens DDX1

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PDF, English (DEAD-box RNA Helikasen)
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Abstract

RNA helicases are essential in all steps of RNA maturation, beginning with transcription and ending with RNA decay. They catalyze the separation of nucleic acid double strands and thereby facilitate structural remodeling. Their cellular importance is reflected in severe diseases caused by RNA helicase dysregulation. The largest group of RNA helicases is confined by the so called DEAD-box helicases of superfamily 2, characterized by the signature sequence D-E-A-D. DEAD-box helicases share a structurally conserved core of two RecA-like domains that carry signature motifs involved in ATP-binding, ATP-hydrolysis, RNA-binding and RNA-remodeling. An exceptional member of the DEAD-box protein family is the human RNA helicase DDX1 (DEAD-box helicase 1). In contrast to all other family members, DDX1 harbors a SPRY domain insertion in between the signature motifs of the helicase core. DDX1 is involved in a plethora of different RNA maturation processes and has been associated with tumor progression. Moreover due to its versatile function in RNA processing, it is hijacked by viruses for their replication. This medical relevance makes DDX1 a potential target for the development of pharmaceutics; however, such an approach would require mechanistic insights into DDX1 function. This thesis therefore aimed at the structural and functional characterization of DDX1. The structure of the SPRY domain was determined to near atomic resolution. This structure showed two layers of concave shaped, anti-parallel β-sheets that stack onto each other. A comparison with structures of previously described SPRY domains revealed that the general fold is conserved, but the loops that mediate the interaction with partner proteins in other SPRY structures show distinct conformations and sequences in human DDX1-SPRY. A patch of positive surface charge is found in proximity of these interaction loops that is conserved within DDX1 SPRY domains and may replace the canonical protein-protein interaction surface. Based on its orientation in a homology model of DDX1, the SPRY domain possibly also enlarges the RNA binding site of the helicase core. The structural analysis is complemented by a detailed biochemical and biophysical characterization of DDX1 including the SPRY domain. Equilibrium titrations and transient kinetics with fluorescent nucleotide analogs were used to determine ATP- and ADP-binding affinities. The binding of ADP is unexpectedly tight and ADP-affinity is one of the tightest observed for DEAD-box proteins. DDX1 binds ADP tighter by a factor of almost 1000, when compared to its ATP-affinity; the latter is in the range of what has been reported for other helicases. Thus, the enzyme would be arrested in an inactive ADP-bound conformation under physiological conditions. These observations suggest that a nucleotide exchange factor – as described for the DEAD-box protein DDX19 – is necessary to resolve this ADP-stalling dilemma. Furthermore, the affinity for RNA and the influence of RNA on ATP/ADP binding was determined. Analysis of the data revealed synergistic effects of RNA and ATP binding, which were also reflected in RNA stimulated ATP hydrolysis. These observations concluded in a working model for DDX1, in which both, RNA and ATP per se have the ability to induce a conformational change to an “active” state of the helicase. In conclusion this thesis provides the first structural information on DDX1 and by presenting the SPRY domain structure, it gives insights into the unique protein-protein interaction domain insertion. The biochemical data provide mechanistic details, show an unsual tight ADP binding and cooperativity in ATP and RNA binding, and allowed developing a model for DDX1 substrate binding.

Translation of abstract (German)

RNA Helikasen spielen eine entscheidende Role im gesammten Lebenszyklus eines RNA Moleküls, beginnend bei der Transkription bis hin zum schlußendlichen Abbau. Sie katalysieren das Aufschmelzen eines Nukleinsäure-Doppelstranges und helfen damit 3-dimensionale Strukturen aufzubrechen und neu zu formen. Ihre wichtige zelluläre Bedeutung zeigt sich in schweren Krankheitserscheinungen, die mit der Fehlregulation von RNA Helikasen verknüpft sind. Die sogenannten DEAD-box Helikasen der Superfamilie 2, die sich über ihre charakteristische Aminosäure-Signatur D-E-A-D definieren, stellen die größte Gruppe von RNA Helikasen dar. Sie alle teilen sich einen strukturell konservierten Kern, bestehend aus zwei Domänen, die beide dem Protein RecA ähnlich sind und die charakteristische Motife beinhalten, die in die ATP-Bindung, ATP-Hydrolyse, RNA-Bindung und RNA-Umformung involviert sind. Die menschliche RNA Helikase DDX1 (steht für DEAD-box Helikase 1) stellt ein außergewöhnliches Mitglied der DEAD-box Familie dar. Im Gegensatz zu allen anderen Familienmitgliedern wird die konservierte Grundstruktur in DDX1 durch eine SPRY Domäne unterbrochen, die sich mitten zwischen den charakteristischen Helikase Motifen befindet. DDX1 ist an einer Vielzahl unterschiedlicher RNA Reifungsprozesse beteiligt und wird auch mit der Entwicklung von Tumoren in Verbindung gebracht. Die funktionelle Vielseitigkeit in der RNA Prozessierung bringt zudem mit sich, dass Viren DDX1 für ihre Vermehrung zweckentfremden. Aufgrund der medizinischen Bedeutung, ist DDX1 ein mögliches Ziel für die Entwicklung von Pharmazeutika, allerdings würde eine solche Entwicklung grundlegende mechanistische Kenntnisse über die Funktion von DDX1 vorraussetzen. Die Zielsetzung dieser Arbeit war daher eine stukturelle und funktionelle Charakterisierung von DDX1. Die Struktur der SPRY Domäne wurde bis zur nah-atomaren Auflösung bestimmt. Diese Struktur zeigte zwei Schichten von konkav geformten, anti-parallelen β-Faltblättern, die aufeinander gestapelt sind. Im Vergleich mit Strukturen von bereits bekannten SPRY Domänen scheint zwar die generelle Struktur erhalten zu sein, aber es fällt auf, dass die Peptid-Ketten, die in anderen SPRY Domänen den Kontakt zu Partner Proteinen herstellen, deutlich unterschiedliche Konformationen und Sequenzen in der SPRY Domäne von DDX1 zeigen. Ein Bereich mit positiver Oberflächenladung findet sich in der Nähe dieser Peptid-Ketten, der innerhalb der SPRY Domänen von verschiedenen DDX1 Homologen aus unterschiedlichen Organismen konserviert ist und eventuell die kanonische Oberfläche ersetzt, die klassischerweise für Protein-Protein Interaktion von SPRY Domänen zuständig ist. Basierend auf der Orientierung der SPRY Domäne in einem Homologie-Modell von DDX1, könnte sie eventuell auch die RNA Bindungsstelle des Helikase Grundgerüstes erweitern. Die strukturellen Ergebnisse dieser Arbeit werden von einer detaillierten biochemischen und biophysikalischen Charakterisierung der kompletten DDX1 Helikase (inklusive der SPRY Domäne) komplettiert. Mit Hilfe von Gleichgewichtstitrationen und transienten Kinetik Messungen mit fluoreszenten Nukleotid-Analoga konnten ATP- und ADP Affinitätskonstanten bestimmt werden. Die Bindung von ADP war unerwartet fest und die ADP Affinität gehört zu den festesten, die je für DEAD-box Proteine gemessen wurden. ADP bindet fast 1000fach fester als ATP, wobei die Affinität für ATP im Bereich dessen ist, was auch für andere Helikasen berichtet wurde. Die hohe Affinität zu ADP würde dafür sorgen, dass das Enzym unter physiologischen Bedingungen in einem inaktiven ADP-gebundenen Zustand stecken bleibt. Dies wiederum suggeriert, dass ein Nukleotid-Austausch-Faktor – wie bereits für das DEAD-box Protein DDX19 beschrieben – vonnöten ist um diese Blockierung durch ADP zu beseitigen. Desweiteren wurden die Affinität für RNA und der Einfluß von RNA auf die Bindung von ATP/ADP bestimmt. Die Ergebnisse zeigten synergistische Effekte zwischen der Bindung von RNA und ATP, welche auch bei der Messung der RNA stimulierten ATP Hydrolyse zur Tage treten. Auf der Basis dieser Effekte wurde ein Arbeitsmodell für DDX1 entworfen, in welchem sowohl RNA also auch ATP an sich die Eigenschaft haben eine Konformationsänderung zu einem aktiven Zustand der Helikase herbeizuführen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit mit der Struktur der SPRY Domäne die ersten strukturellen Informationen über DDX1 liefert und Einblicke in die einzigartige Protein-Protein Interaktions-Domänen Insertation gibt. Die biochemischen Daten liefern mechanistische Details, zeigen eine ungewöhlich starke ADP Bindung und synergistische Effekte in der Bindung von ATP und RNA, und erlauben es ein Model für die Substrat-Bindung an DDX1 zu entwickeln.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Meinhart, Dr. rer. nat. Anton
Place of Publication: Unibibliothek Heidelberg
Date of thesis defense: 10 July 2014
Date Deposited: 28 Jul 2014 11:59
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > Max-Planck-Institute allgemein > MPI for Medical Research
Subjects: 000 Generalities, Science
570 Life sciences
Controlled Keywords: Helicasen, Transfer-RNS, Adenosintriphosphatasen, Röntgenkristallographie, Fluoreszenzspektroskopie
Uncontrolled Keywords: RNA-Helikasen, DEAD-box Proteine, RNA-Bindung, RNA-Prozessierung, ATP-Hydrolyse, kooperative ATP und RNA Bindung, Strukturbiologie, Röntgenkristallographie
Additional Information: We thank the scientific staff at the Max-Planck-Institute for Medical Research (Heidelberg, Germany) for discussions, help and continuous encouragement. This work was funded by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft to Anton Meinhart (ME3135/1-2) and the Max-Planck-Society.
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