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RNA Affinity Purification and Characterization of Roquin Proteins in CDE-mediated mRNA Decay

Leppek, Kathrin

German Title: RNA Affinitätsaufreinigung and Charakterisierung von Roquin Proteinen in CDE-vermitteltem mRNA Abbau

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PDF, English (Kathrin Leppek, PhD Thesis) - main document
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Abstract

Tumor necrosis factor (TNF)-α is the most potent pro-inflammatory cytokine in mammals. The degradation of TNFα mRNA is critical for restricting TNFα synthesis and involves an AU-rich element (ARE) and a constitutive decay element (CDE) in the 3' untranslated region (UTR) of the mRNA. In the first part of my thesis, I optimized an RNA-based method to identify RNA-binding proteins (BPs) associated with TNFα mRNA. For this, I developed a modified streptavidin-binding RNA aptamer termed S1m. It has improved affinity for streptavidin and I found a four-fold repeat (4xS1m) to be most efficient. I then used TNFα ARE-4xS1m RNA to purify ARE-BPs from cellular extracts. By this, I found the majority of established ARE-BPs and confirmed Rbms1 and Roxan as novel ARE-BPs. The optimized 4xS1m aptamer therefore provides a powerful tool for the discovery of ribonucleoprotein (RNP) components. In the second part of my thesis, I investigated the TNFα CDE in detail and found that the CDE is a 17 nucleotide long structured motif. Structural probing and mutagenesis provide evidence that it folds into a short RNA stem-loop in its active conformation. Using my 4xS1m protocol, I then identified CDE-associated proteins by mass spectrometry. Thereby, I found that the CCCH-type zinc and RING finger proteins Roquin (Rc3h1) and its paralog Roquin2 (Rc3h2) are stem-loop specific CDE-BPs. Next, I confirmed that the ROQ domain of Roquin specifically and directly binds to the CDE stem-loop. I could further show that Roquin is required for CDE-mediated mRNA decay and suppression of TNFα production in macrophages. TNFα expression was also increased by introduction of a morpholino that interferes with CDE-Roquin binding. My data provide evidence that Roquin proteins promote mRNA degradation by recruiting the Ccr4-Caf1-Not deadenylase complex. CDE motifs are highly conserved and are found in over 50 vertebrate mRNAs, many of which encode regulators of development and inflammation. In macrophages, I confirmed that CDE-containing mRNAs are the primary targets of Roquin on a transcriptome-wide scale. Thus, Roquin proteins act broadly as mediators of mRNA deadenylation by recognizing a conserved class of stem-loop RNA degradation motifs. In all, I unraveled a mechanism that adds an important component to the complex network that governs posttranscriptional control of gene expression.

Translation of abstract (German)

Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α ist das wirksamste pro-inflammatorische Zytokin in Säugetieren. Der Abbau der TNFα mRNA ist entscheidend für die begrenzte Herstellung von TNFα und schließt ein AU-reiches Element (ARE) und ein konstitutives Abbauelement (CDE) in der 3' untranslatierten Region (UTR) der mRNA ein. Im ersten Teil meiner Doktorarbeit optimierte ich eine RNA-basierte Methode um RNA-Bindeproteine (BP), die mit der TNFα mRNA assoziiert sind, zu identifizieren. Dazu entwickelte ich ein modifiziertes Streptavidin-bindendes RNA Aptamer, genannt S1m. Es hat eine verbesserte Affinität zu Streptavidin, und ich fand heraus, dass eine vierfache Verkettung (4xS1m) am effizientesten ist. Dann verwendete ich TNFα ARE-4xS1m RNA, um ARE-BPe aus zellulären Extrakten zu reinigen. Dadurch fand ich die meisten etablierten ARE-BPe und bestätigte Rbms1 und Roxan als neue ARE-BPe. Das optimierte 4xS1m Aptamer stellt damit ein leistungsstarkes Hilfsmittel dar, um Ribonukleinsäure-Protein (RNP) Komponenten zu entdecken. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit untersuchte ich das TNFα CDE im Detail und fand heraus, dass das CDE ein 17 Nukleotid-langes strukturiertes Motif ist. Strukturanalyse und Mutagenese zeigten, dass es sich in seiner aktiven Konformation in einen kurzen RNA Stem-Loop faltet. Indem ich das 4xS1m Protokoll anwendete, identifizierte ich dann CDE-assoziierte Proteine durch Massenspektrometrie. Dadurch fand ich, dass die CCCH-Typ Zink und RING Finger Proteine Roquin (Rc3h1) und dessen Paralog Roquin2 (Rc3h2) Stem-Loop-spezifische CDE-BPe sind. Anschließend bestätigte ich, dass die ROQ Domäne von Roquin spezifisch und direkt an den CDE Stem-Loop bindet. Ich zeigte weiterhin, dass Roquin notwendig ist für CDE-vermittelten mRNA Abbau und für die Suppression der TNFα Produktion in Makrophagen. TNFα Expression stieg durch das Einbringen eines Morpholinos an, das mit der CDE-Roquin Bindung interferiert. Meine Daten zeigen, dass Roquin Proteine mRNA Abbau fördern, indem sie den Ccr4-Caf1-Not Deadenylase Komplex rekrutieren. CDE Motive sind hochkonserviert in Vertebraten und finden sich in über 50 mRNAs, von denen viele für Entwicklungs- und Entzündungsregulatoren kodieren. Ich bestätigte CDE-enthaltende mRNAs als primäre Zielgruppe von Roquin auf Traskriptom-weiter Ebene in Makrophagen. Folglich agieren Roquin Proteine weitgehend als Vermittler von mRNA Deadenylierung indem sie eine konservierte Klasse von Stem-Loop RNA Abbaumotiven erkennen. Insgesamt entschlüsselte ich einen Mechanismus, der dem komplexen System, das die posttranskriptionelle Kontrolle von Genexpression steuert, eine wichtige Komponente hinzufügt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bukau, Prof. Dr. Bernd
Date of thesis defense: 10 March 2014
Date Deposited: 26 Aug 2014 12:48
Date: 2014
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Streptavidin, S1, S1m, RNP, mRNP, mRNA, RNA-binding protein, AU-rich element, ARE, RNA structure, mRNA deadenylation, RNA-binding protein, constitutive decay element, CDE, Rc3h1, Rc3h2, macrophage, TNF, tumor necrosis factor-α
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