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Identification and validation of novel protein biomarkers in pancreatic ductal adenocarcinoma with the ability to distinguish molecular subtypes

Kuhlmann, Laura

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Abstract

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest forms of cancer, with a medium overall survival of only six months. The standard of care treatment, consisting of surgical resection followed by adjuvant chemotherapy, which incidentally can be offered to as little as 20% of the newly diagnosed patients, shows only marginal benefit for patients and no significant improvements to PDAC therapy have been made over the past two decades. PDAC is currently treated as a single, homogenous disease. Recently, three molecular subtypes termed classical, exocrine-like and quasimesenchymal (QM) have been defined, based on transcriptomic profiling of micro-dissected cancer cells from primary tumors and commercially available cell lines. The newly defined molecular subtypes were associated with differences in patient overall survival and are suggested to predict response to different chemotherapeutical agents. However, no clinical markers are available for the stratification of patients according to these molecular subtypes. The aim of this study was the identification and validation of novel pan-PDAC as well as subtype-specific protein biomarker candidates, which can be employed in the development of novel clinical applications, such as diagnostics and/ or targeted PDAC therapies. Using a panel of twelve patient derived primary pancreatic cancer cell lines, grown in a chemically defined serum free medium, we employed LC-MALDI-MS to identify novel cell surface and secreted PDAC protein biomarker candidates. Two commercially available healthy pancreatic cell lines served as controls. The cell surface proteome was analyzed following in vitro biotinylation and subsequent streptavidin pull-down of the covalently biotin-labeled proteins, while the secreted proteome was analyzed by shotgun proteomics. In addition, we investigated in vivo vascular accessible PDAC biomarkers, by carrying out whole body perfusions of mice bearing orthotopic pancreatic tumors using a reactive biotin ester solution. Biomarker candidates of interest were selected after the proteomics discovery experiment and underwent thorough validations, using complementary antibody based (immunofluorescence, Western Blot) and antibody independent (single reaction monitoring, RT-qPCR) techniques. The validation experiments were performed both in vitro – using the PDAC cell culture model and in vivo – using tumor xenografts developed in immunodeficient mice. More than 2500 proteins were identified after completing the cell surface proteome analysis, and over 1700 proteins could be reported in the conditioned cell culture medium. We selected the two pan-PDAC biomarker candidates, Pan-marker-1 and Pan-marker-2, as well as the two exocrine-like biomarker candidates, Exo-1 and Exo-2, for further validations. In vitro immunofluorescence confirmed the exclusive presence of Pan-marker-1 and Pan-marker-2 on the surface of primary patient-matched PDAC cell lines, which correlated with elevated levels of the corresponding mRNAs. The expression of the two exocrine-like protein biomarker candidates was restricted to the predicted subtype, as proven by immunofluorescence and single reaction monitoring. The secretion of the two exocrine-like proteins in the cell culture medium was additionally confirmed by single reaction monitoring. The regulation of the two exocrine-like PDAC biomarkers was at least partially due to the upregulation of the corresponding mRNAs. Additionally, we could report that Exo-1 and Exo-2 colocalize on the surface of cultured exocrine-like PDAC cells. In vivo immunofluorescence analyses corroborated the presence of Pan-marker-1 and Pan-marker-2 on the surface of pancreatic cancer cells and in the tumor environment, while being completely absent in healthy human pancreata. Exocrine-like tumor xenografts expressed Exo-1 and Exo-2 at high levels, as evaluated by immunofluorescence. However, a limited activation of the two putative exocrine-like biomarkers could be detected in vivo in some of the classical pancreatic tumors. Protein expression patterns correlated with reported levels of the respective mRNAs for all the investigated biomarker candidates, evaluated in both EpCam+ epithelial cells isolated from orthotopic xenografts and whole tumor tissue. Moreover, Pan-marker-2 and Exo-2 could be detected in the course of a proof-of-principle in vivo perfusion experiment using mice harboring orthotopic tumors. Therefore, we could conclude that the two proteins are accessible from the blood stream and could represent candidates for novel PDAC targeted therapies.

Taken together, our study identifies novel pan-PDAC as well as subtype-specific protein biomarkers candidates, which can be used in clinical applications for patient stratification. Additionally, the proteins were secreted by pancreatic cancer cells, and could therefore represent the basis for developing novel non-invasive diagnostic tools. Importantly, the validated protein biomarker candidates were also accessible from the vascular system, making them eligible targets for novel antibody based therapies of PDAC.

Translation of abstract (German)

Das duktale Pankreasadenokarzinom weist unter allen Krebserkrankungen eine der höchsten Mortalitätsraten auf, die mittlere Überlebenrate nach der Diagnose beträgt nur 6 Monate. Die Standardbehandlung bestehend aus operativer Entfernung des Tumors gefolgt von adjuvanter Chemotherapie kann lediglich bei 20% der neu diagnostizierten Patienten angewandt werden und zeigt zudem nur geringen Nutzen für die Patienten. In den vergangenen zwei Jahrzehnten konnte die Therapie trotz intensiver Bemühungen sowohl seitens akademischer Forschungsstellen als auch seitens der pharmazeutischen Industrie nicht signifikant verbessert werden. Duktales Pankreasadenokarzinom wird derzeit bei allen Patienten einheitlich behandelt. Vor kurzem wurden, basierend auf Genexpressionsprofilen von durch Lasermikrodissektion aus humanem Tumorgewebe generierten Krebszellen sowie kommerziell erhältlichen Zelllinien, drei molekulare Subtypen des duktalen Pankreasadenokarzinoms (klassisch, exokrin-ähnlich und quasimesenchymal) beschrieben. Diese neu definierten molekularen Subtypen wurden mit unterschiedlichen Überlebensraten der Patienten assoziiert. Darüber hinaus können diese vermutlich zur Vorhersage des Behandlungserfolges mit verschiedenen Chemotherapeutika dienen. Jedoch gibt es noch keine klinischen Marker für die Stratifizierung von Patienten nach diesen molekularen Subtypen. Das Ziel dieser Studie war die Identifizierung und Validierung neuer Pan- und Subtyp-spezifischer Protein-Biomarkerkandidaten des duktale Pankreasadenokarzinoms, welche zur Entwicklung neuer Diagnostika und zielgerichteter Therapien genutzt werden können. Anhand von zwölf aus Patientenmaterial abgeleiteten, primären Zelllinien, die in serum-freiem Medium kultiviert wurden, konnten mittels LC-MALDI-MS neue Zelloberflächen- und sekretierte Biomarkerkandidaten idenfiziert werden. Dabei dienten zwei kommerziell erhältliche, gesunde Pankreas-Zelllinien als Kontrollgruppe. Die Analyse des Zelloberflächenproteoms erfolgte durch in vitro-Biotinylierung der Zellen mit darauffolgender Affinitäts-basierter Anreicherung der kovalent markierten Proteine auf Streptavidin, wohingegen das sekretierte Proteom durch einen Shotgun-Ansatz untersucht wurde. Darüberhinaus wurden vaskulär erreichbare Biomarker durch in vivo-Perfusion von orthotop pankreastumortragenden Mäusen mit einem reaktiven Biotin-Ester Derivat markiert und analysiert. Aus den Proteom-Daten wurden daraufhin interessante Biomarkerkandidaten ausgewählt und mittels komplementären, auf Antikörpern basierenden Techniken (Immunfluoreszenz, Western Blot) sowie Antikörper-unabhängigen Techniken (Single Reaction Monitoring, RT-qPCR) validiert. Die Validierung erfolgte sowohl in vitro auf Zellkulturmodellen als auch in vivo mittels Tumor-Xenotransplantaten in immundefizienten Mäusen. Durch die Analyse des Zelloberflächenproteoms konnten mehr als 2500 Proteine identifiziert werden, im konditionierten Zellkulturmedium wurden über 1700 Proteine entdeckt. Zur weiteren Validierung wurden die zwei Pan-Biomarkerkandidaten Pan-marker-1 und Pan-marker-2 sowie die zwei exokrin-ähnlichen Biomarkerkandidaten Exo-1 und Exo-2 ausgewählt. Durch Immunfluoreszenz wurde das spezifische Vorhandensein von Pan-marker-1 und Pan-marker-2 auf der Zelloberfläche von Zelllinien, die von humanem duktalen Pankreasadenokarzinomen abgeleitet wurden, bestätigt, was darüberhinaus mit erhöhten Konzentrationen der korrepondierenden mRNAs korreliert. Wie durch Immunfluoreszenz und single reaction monitoring gezeigt wurde, erwies sich die Expression der zwei exokrin-ähnlichen Biomarkerkandidaten wie vorhergesagt als beschränkt auf den exokrin-ähnlichen Subtyp. Die Sekretion der zwei exokrin-ähnlichen Subtyp-spezifischen Proteine in das Zellkulturmedium wurde darüber hinaus durch single reaction monitoring bestätigt. Die Regulation der zwei exokrin-ähnlichen Biomarker korrelierte dabei mit den erhöhten Konzentrationen der korrespondierenden mRNAs. Darüber hinaus konnte die Kolokalisierung von Exo-1 und Exo-2 auf der Oberfläche von dem exokrin-ähnlichen Subtyp zugeordeten Zellen gezeigt werden. Die in vivo Immunfluoreszenz-Analysen konnten die Präsenz von Pan-marker-1 und Pan-maker-2 auf der Oberfläche von Pankreastumorzellen und in der Umgebung des Tumors bestätigen, wohingegen die Biomarker in gesundem, humanen Pankreasgewebe nicht nachgewiesen werden konnten. Exokrin-ähnliche zugeordnete Xenotransplantate überexprimierten Exo-1 und Exo-2 ebenfalls stark, wie durch Immunfluoreszenz gezeigt werden konnte. Jedoch konnte eine geringe Aktivierung der zwei mutmaßlich exokrin-ähnlichen Subtyp-spezifischen Biomarker in vivo auch im klassischen Subtyp detektiert werden. Die Proteinexpression korreliert für alle Biomarkerkandidaten stark mit den erhaltenen Konzentrationen der korrespondierenden mRNAs, welche in EpCam positiven Epithelzellen aus orthotopen Xenotransplantaten und Tumorgewebe evaluiert wurden. Darüber hinaus konnten Pan-marker-2 und Exo-2 in einem in vivo-Perfusionsexperiment mit orthotop tumortragenden Mäusen detektiert werden. Daraus lässt sich folgern, dass die zwei Protein-Biomarker vaskulär zugänglich und somit vielversprechende Kandidaten für neue zielgerichteten Therapien darstellen. In dieser Studie wurden neue Pan- und Subtyp-spezifische Protein-Biomarkerkandidaten für das duktale Pankreasadenokarzinom identifiziert, die klinisch zur Stratifizierung von Patienten genutzt werden können. Darüber hinaus werden diese Proteine von Pankreastumorzellen sekretiert und können daher auch als Basis für die Entwicklung neuartiger, nicht invasiver Diagnostika dienen. Die validierten Biomarkerkandidaten sind zudem durch das Blutgefäßsystem zugänglich, was sie zu geeigneten Zielstrukturen für neue Antikörper-basierte Therapien des duktalen Pankreasadenokarzinoms macht.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Trumpp, Prof. Dr. Andreas
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 18 September 2014
Date Deposited: 17 Oct 2014 06:26
Date: 2015
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
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