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Influence of Post-translational Modifications on Hsp90 Activity and Function

Nguyen, Minh T. N.

German Title: Einfluss Post-translationaler Modifizierungen auf Hsp90 Activität und Funktion

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Abstract

The 90 kDa heat shock proteins constitute a family of highly conserved molecular chaperones that are essential in all eukaryotic cells. Assisted by an increasing number of cochaperones, Hsp90 forms highly dynamic complexes with numerous client proteins, many of which are signaling molecules controlling cell homeostasis, proliferation, differentiation, cell death, etc. Therefore, Hsp90 sits at one of the center positions in the protein quality control system and requires delicate regulation by the combination of different mechanisms. It is already well established in the field that the multiple conformations of Hsp90 are driven by association/dissociation with nucleotide and ATP hydrolysis together with binding and release of cochaperones as well as client proteins. On the other hand, post-translational modifications are becoming increasingly recognized as another layer of regulation that adds up to the complexity of the whole machinery. Hsp90 is a phospho-protein: approximately 40 sites have been detected in proteomics reports; nonetheless, individual phospho-sites seem to have different impact on the chaperone function of Hsp90. In the first part of this work, I aimed to analyze the global phosphorylation status of human cytosolic Hsp90 proteins in cancer versus non-cancer cells in a quantitative way and to examine whether the phosphorylation status relates to tumor selectivity characteristics of Hsp90 inhibitors.I found indications for novel phosphorylation sites that were not covered in proteomics studies so far. In the second part of this work, I focused on characterzing a novel serine phosphorylation that was first detected in the previous part and recently has been confirmed by other proteomics studies. Using S. cerevisiae as the model system in which both endogenous Hsp90 can be conditionally deleted, I was able to resolve the difference in chaperone function of human Hsp90 wild-type and phospho-mutants when being the sole source of Hsp90 proteins in yeast cells. My data suggested that the human Hsp90 wild-type was indeed phosphorylated in vivo and demonstrated strongly a correlation between phosphorylation and chaperone activity of Hsp90. My results supported a hypothesis in which a single modification on the molecular chaperone would be sufficient to provide a certain level of client specificity and modulate cellular responses upon environmental stimuli. To resolve further the mechanism of how this specific phosphorylation exerts its impact on Hsp90 function, I utilized in vitro minimal GR-activation system consisting of purified Hsp70, Hsp40, HOP, p23 and different Hsp90 wild-type or phospho-variant proteins. The profitable effect of the phospho-mimetic variant as compared with non-phosphorylatable variants was confirmed while that of wild-type protein was abolished due to the lack of post-translational modifications from E. coli expression and purification. I also examined the interaction of the Hsp90 wild-type protein and the phosphomutants with cochaperones by size-exclusive chromatography coupled with fluorescence detector using labeled proteins and isothermal titration calorimetry. The results showed that this phosphorylation impairs the binding of Hsp90 protein to both cochaperones Aha1 and Cdc37. Altogether, the data provided evidence for phosphorylation at this serine position on human Hsp90 that contributes to regulation of Hsp90 function via direct impacts on client and indirect effects via cochaperones involved in the chaperone cycle. As expected, the regulation of this molecular chaperone is the result of a delicate combination between several mechanisms rather than a single one, which would be more flexible to adapt to the variety of macro- and micro-environmental fluctuations that higher eukaryotes always must cope with.

Translation of abstract (German)

Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, den globalen Phosphorylierungszustand der humanen, cytosolischen Hsp90-Proteine in Krebszellen im Vergleich zu nicht malignen Zellen quantitativ zu analysieren und zu prüfen, ob der Phorphorylierungsstatus mit Tumorselektivitätseigenschaften von Hsp90-Inhibitoren in Zusammenhang steht. Stattdessen fand ich Hinweise auf neue Phosphorylierungsstellen, die bis dahin noch nicht von Proteom-Studien worden waren. In dem zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierte ich mich auf die Charakterisierung einer neuen Serinphosphorylierung, die erstmals im vorherigen Teil beschrieben und kürzlich auch durch andere Proteom-studien bestätigt wurde. Mit S. cerevisiae als Modellsystem, in dem beide endogene Hsp90 codierende Gene durch ein Hsp90 Gen des Menschen ersetzt wurde, war ich in der Lage, Unterschiede in der Chaperonfunktion vom humanen Hsp90β-Wildtyp und den Phospho-Mutanten festzustellen. Meine Daten wiesen darauf hin, dass der Hsp90β-Wildtyp in vivo tatsächlich phosphoryliert war. Zudem zeigte sich eine starke Korrelation zwischen der Phosphorylierung und der Chaperonaktivität von Hsp90β. Meine Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass eine einzige Modifikation der molekularen Chaperone ausreichen würde, um einen bestimmten Grad an Klientenspezifität zu bestimmen und zelluläre Antworten auf Umweltreize modulieren zu können. Um weiterhin die Mechanismen aufzuklären, wie diese Phosphorylierung sich auf die Hsp90-Funktion auswirkt, verwendete ich ein in vitro Minimal-GR-Aktivationssystem bestehend aus aufgereinigtem Hsp70, Hsp40, HOP, p23 und Hsp90-Wildtyp oder verschiedene Hsp90-Phospho-Varianten. Es wurde bestätigt, dass die Phospho-mimetische Variante einen günstigen Effekt im Vergleich zu den nicht phosphorylierbaren Varianten hat, während dies für das Wildtyp-Protein aufgrund der fehlenden posttranslationalen Modifikationen infolge der E.coli Expression und Aufreinigung nicht der Fall war. Ich untersuchte auch die Interaktion von Hsp90-Wildtyp und diesen Phosphomutanten mit Cochaperonen mittels Größenausschluss-chromatographie und isothermer Titrationskalorimetrie. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Phosphorylierung die Bindung von Hsp90β-Proteinen an die Cochaperone Aha1 und Cdc37 beeinträchtigt. Alles in allem bieten diese Daten einen Beleg dafür, dass die Phosphorylierung des Position im Hsp90β des Menschen zur Regulation der Hsp90-Funktion beiträgt, einerseits über direkte Auswirkungen auf Protein Klienten und anderseits indirekt durch Effekte auf Cochaperone, die in diesem Chaperonzyklus beteiligt sind. Wie erwartet, ist die Regulation dieses molekularen Chaperons eher das Resultat einer fein abgestimmten Kombination aus verschiedenen Mechanismen, als das Ergebnis eines einzelnen Mechanismus. Ersteres System wäre flexibler in der Adaption an große und kleinste Umweltschwankungen, welche höhere Eukaryoten immer bewältigen müssen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mayer, Prof. Dr. Matthias
Place of Publication: Heidelberg, Germany
Date of thesis defense: 19 September 2014
Date Deposited: 09 Dec 2014 14:12
Date: 2016
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Hsp90, Phosphorylation
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