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B-cell receptor signaling- and p53-dependent non-coding RNA expression in chronic lymphocytic leukemia

Blume, Carolin J.

German Title: Die Expression B-Zell-Rezeptor- und p53-abhängiger nicht-kodierender RNA in der Chronisch Lymphatischen Leukämie

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Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common type of leukemia in adults of the Western world. It is a malignancy characterized by an accumulation of CD5 positive B-cells in blood and lymphoid organs. CLL is a very heterogeneous disease, where molecular subgroups display striking differences in treatment response and prognosis. A greater BCR signaling capacity and a loss of p53 signaling activity confer a poor prognosis. While the higher BCR signaling activity seen in CLL with unmutated IGHV genes supports tumor cell survival, p53 aberrations mediate resistance towards standard therapy. The aim of this work was to characterize the involvement of non-coding RNA in these two key signaling pathways of CLL cell survival and resistance. Small RNA sequencing was applied to comprehensively assess microRNA (miRNA) and other non-coding RNA expression in peripheral blood mononuclear cells of 35 CLL patients. miRNAs were identified that display IGHV mutation status dependent expression, and the transcript levels of 15 miRNAs predicted IGHV mutation status with 82% accuracy. By abrogation of BCR signaling in vitro using the small-molecule inhibitor ibrutinib, the expression of miR-320c, miR-1246, miR-484, miR-17-5p, miR-155-3p and miR-27a-5p was found to be BCR signaling dependent, suggesting a role in mediating CLL cell survival. The basal expression of 10 miRNAs was associated with ibrutinib sensitivity in vitro, implicating an involvement of these miRNAs in the regulation of BCR signaling. It was hypothesized that p53-dependent ncRNAs could be identified by comparison of CLL samples with or without TP53 mutation/deletion for their ncRNA expression changes upon DNA damage-triggered p53 induction. In addition to miR-34a, a set of further miRNAs was found to be TP53 status dependently induced (particularly miR-182-5p, miR-7-5p and miR-320d/c). Beyond miRNAs, the present data demonstrate p53-dependent expression of the long non-coding RNAs lincRNA-p21 (long intergenic non-coding RNA p21) and NEAT1 (nuclear enriched abundant transcript 1) upon DNA damage and direct p53 activation with nutlin-3. p53-dependent induction of expression was further proven in a panel of Burkitt’s lymphoma (BL) cell lines including cell lines with genetically engineered knockout or knockdown of p53. p53 ChIP demonstrated direct binding of p53 to the NEAT1 promoter. This provides first evidence of p53-dependent regulation of long non-coding RNAs in CLL and BL. The discovery of p53-dependent NEAT1 induction, which is an integral part of nuclear paraspeckles, paves the way for further research on the role of paraspeckles in tumor cell apoptosis and resistence. The current work identifies additional components of the p53-dependent DNA damage response in lymphoma. The results of these studies provide new insight into the involvement of miRNAs and lncRNAs in two key signaling pathways regulating cell survival and treatment resistance in CLL and lymphoma.

Translation of abstract (German)

Die chronisch lymphatische Leukämie (CLL) ist die häufigste Form der Leukämie in Erwachsenen der westlichen Hemisphäre. Charakteristisch für diese maligne Erkrankung ist die Akkumulation von CD5 positiven B-Zellen im Blut und in den Lymphorganen. CLL ist eine sehr heterogene Erkrankung, in der molekulare Subgruppen bemerkenswerte Unterschiede im Hinblick auf Therapieansprechen und Prognose zeigen. Eine erhöhte Kapazität des B-Zell-Rezeptor (BCR) Signalwegs wie auch ein Verlust der Aktivität des p53-Signalwegs bedingen eine schlechte Prognose. Während unmutierte IGHV Gene über eine höhere Aktivität des BCR Signalwegs zu einem verbesserten Überleben der Tumorzellen führen, vermitteln Aberrationen in dem Tumorsuppressor p53 Therapieresistenz. Ziel dieser Arbeit war es, die Beteiligung von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) in diesen beiden für das Überleben und die Resistenz von CLL-Tumorzellen zentralen Signalwegen zu charakterisieren. Um die Expression von microRNA (miRNA) und weiteren nichtkodierenden RNA (ncRNA) in mononukleären Zellen des periphären Blutes von 35 CLL Patienten umfassend zu quantifizieren, wurden kurze RNA Transkripte (small RNA) sequenziert. Es wurden IGHV-Mutationsstatus abhängig exprimierte miRNAs identifiziert, und anhand der Signatur von 15 miRNAs ließ sich der IGHV Mutationsstatus in 82% der Proben korrekt bestimmen. Eine Unterbrechung des BCR Signalwegs durch in vitro-Behandlung mit dem small-molecule Inhibitor Ibrutinib führte zur differenziellen Expression von miR-320c, miR-1246, miR-484, miR-17-5p, miR-155-3p und miR-27a-5p, was deren Abhängigkeit von einem aktiven BCR demonstriert und eine Beteiligung an diesem überlebensfördernden Signalweg nahelegt. Die Assoziation der basalen Expression von 10 miRNAs mit in vitro Ibrutinib-Sensitivität der Proben impliziert eine Mitwirkung dieser miRNAs an der Regulation der BCR Signalaktivität. p53-abhängige ncRNAs wurden durch einen Vergleich der Expressionsänderungen zwischen TP53 wildtyp und TP53 mutierten/deletierten CLL-Proben nach p53 Induktion durch DNA-Schädigung identifiziert. Zusätzlich zu miR-34a war die Expression einer Gruppe weiterer miRNAs (insbesondere miR-182-5p, miR-7-5p, miR-320d/c) abhängig vom TP53 Mutationsstatus. Über miRNAs hinaus enthüllten die Daten dieser Arbeit die p53-abhängige Expression der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) lincRNA-p21 (long intergenic non-coding RNA p21) und NEAT1 (nuclear enriched abundant transcript 1) nach DNA-Schädigung sowie nach direkter p53-Aktivierung mittels Nutlin-3 in CLL. Deren p53-abhängige Induktion über CLL hinaus wurde anhand einer Auswahl an Burkitt’s Lymphom (BL) Zelllinien, deren p53 Expression teils durch p53 knockout oder knockdown kontrolliert worden war, nachgewiesen. Durch p53 ChIP konnte die direkte Bindung von p53 an den NEAT1 Promoter demonstriert werden. Damit wurde erstmals die p53-abhängige Regulation langer nicht-kodierender RNAs in CLL und BL gezeigt. Die Entdeckung der p53-abhängigen Regulation von NEAT1, einem zentralen Bestandteil nukleärer Paraspeckles, bahnt weiteren Arbeiten zur Rolle der Paraspeckles in Apoptose und Resistenz von Tumorzellen den Weg. Die vorliegende Arbeit identifiziert neue Komponenten der p53-abhängigen Antwort auf DNA-Schäden in malignen Lymphomen. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten neue Einblicke in die Beteiligung von miRNAs und lncRNAs an zwei für die Regulation von zellulärem Überleben und Therapieresistenz zentralen Signalwegen in der CLL und malignen Lymphomen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kalle, Prof. Dr. Christof von
Date of thesis defense: 12 January 2015
Date Deposited: 21 Jan 2015 09:58
Date: 2015
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: p53, non-coding RNA, CLL, B-cell receptor, NEAT1, lincRNA-p21
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