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Genome‐wide detection of induced DNA double strand breaks

Zimmermann, Philipp Konstantin

German Title: Genom-weite Bestimmung von induzierten DNA Doppelstrangbrüchen

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Abstract

DNA Doppelstrangbrüche (DSB) können sowohl natürlich als auch nach Bestrahlung auftreten und stellen eine große Gefahr für die Stabilität des Genoms und Zellviabilität dar. Wird ein DSB nicht effizient repariert, können Veränderungen im Genom wie z.B. Deletionen und Vervielfältigungen auftreten, die ein Markenzeichen von Krebszellen sind. Ist der DNA Schaden allerdings zu groß, kann die Zelle Apoptose induzieren, was das Ziel der Strahlentherapie zur Krebsbehandlung ist. Derzeitige Methoden zur Bestimmung von DSB basieren vor allem auf der Markierung von DNA Reparaturproteinen wie ATM (Ataxia telangiectasia mutated), 53BP1 (53 binding protein 1) und H2AX (phosphoryliertes Histon H2AX) mittels Fluoreszenz‐markierten Antikörpern. Diese Proteine bilden innerhalb weniger Minuten nach der DSB Entstehung mikroskopisch‐sichtbare Zentren an der DSB Stelle, sogenannte Strahlen‐induzierte Zentren (RIF). Obwohl diese Methode Erkenntnisse über die DSB Entstehung und Reparaturkinetik geliefert hat, ist sie limitiert. So kann keine Aussage über die genaue Position des Strangbruchs getroffen werden, da die RIF auf mehrere Megabasen um die DSB Stelle herum vergrößern. Außerdem verschwinden die RIF innerhalb von 24 Stunden nach Bestrahlung, und ermöglichen somit keine weitere Analyse der reparierten DSB Stellen in überlebenden Zellen. Ebenso erlaubt die Immunfärbung keine Aussage über einen möglichen Zusammenhang zwischen der DSB Stelle, der Reparatur und des Schicksals der Zelle. Daher gibt es kaum Informationen darüber, wie Strahlen‐induzierte DSB im Genom verteilt sind, wie solche Schäden zur Radioresistenz führen sowie die Entwicklung von einer normalen Zelle hin zu einer Tumorzelle und die Krebsentstehung beeinflussen. Deshalb stellen wir die Hypothese auf, dass DSB im Genom nicht zufällig verteilt sind und dass die Analyse der genom‐weiten DSB Verteilung nach Bestrahlung in überlebenden Zellen auf Einzelnukleotidebene unser Verständnis über die Mechanismen, die zur Bestrahlungsresistenz führen, verbessert. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden in dieser Arbeit neue Methodenansätze basierend auf der Beobachtung entwickelt, dass Non‐Homologous End Joining (NHEJ) Reparatur zum Einbau von DNA Molekülen ins Genom an DSB Stellen führen kann. Für die DSB Markierung wurden daher Integrase‐defiziente lentivirale Vektoren (IDLV) in Zellen eingebracht, die nach Bestrahlung an transient‐auftretenden DSB Stellen ins Genom stabil eingebaut werden. Diese Integrationsstellen wurden anschließend durch LAM‐PCR und Sequenzierung amplifiziert und identifiziert. Insgesamt wurden somit mehr als 20,000 DSB Stellen im Genom bestrahlter Zellen identifiziert und mit natürlich‐auftretenden und Doxorubicin‐induzierten DSB Stellen verglichen. Die DSB Verteilung wurde mit der Transkriptionsaktivität, verschiedenen Chromatin‐Bereichen und Genfunktionen verglichen. Die Analyse ergab, dass in überlebenden Zellpopulationen das DSB‐Verteilungsmuster nicht zufällig ist. Therapie‐induzierte DSB wurden vermehrt in kleinen genomischen Bereichen, sogenannten Hotspots, die in Grenzregionen von Eu‐ und Heterochromatin und in oder in der Nähe von Onkogenen, Tumorsuppressorgenen und Enhancer Regionen liegen, nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Strahlen‐induzierte Mutationen in überlebenden Zellpopulationen in bevorzugten Bereichen auftreten oder Zellen mit Mutationen in solchen Bereichen selektiert werden. Diese Hotspots können eventuell die Wahrscheinlichkeit für die Entstehung von Therapieresistenzen erhöhen.

Translation of abstract (English)

DNA double strand breaks (DSB) can occur naturally as well as after irradiation and pose a serious threat to genome stability and cell viability. Failure to efficiently repair DSB can result in genomic alterations including deletions and amplifications, which are hallmarks of cancer. If the DNA damage is too severe, apoptosis is induced, which is the main goal in cancer radiotherapy. Current methods for detection of DSB sites following irradiation are mainly based on the immunostaining of DNA repair proteins such ATM (Ataxia telangiectasia mutated), 53BP1 (53 binding protein 1), and H2AX (phosphorylated histone H2AX) by fluorescent‐labeled antibodies. These repair proteins form microscopically‐visible foci at the DSB site referred to as radiationinduced foci (RIF) within minutes after DNA damage induction. Even though immunostaining has provided valuable insights into the mechanisms and kinetics of DSB induction and repair, this method has several limitations. Since RIF span up to several megabases around the DSB site, the precise location of the DSB cannot be determined. Moreover, DNA repair proteins disassemble from the DSB site within 24 hours after DSB induction and do not enable DSB site analysis in radiation‐surviving cells. Furthermore, immunostaining does not provide any molecular information on DSB localization, repair outcome and cell fate decision. Hence, up to now, there is little information on how radiation‐induced and repaired DSB sites are distributed, how radiationinduced DNA damage is being survived and how these damages induce radiation‐resistance, cell transformation and carcinogenesis. Thus, we hypothesize that the distribution of radiation‐induced DSB sites may not be random and that analyzing the genome‐wide distribution of radiation‐induced DSB in surviving cells at singlenucleotide resolution will improve our understanding of the mechanisms of radioresistance. In order to achieve this goal, new methodological approaches were developed based on the observation that DNA repair by nonhomologous end joining (NHEJ) can lead to the genomic integration of episomal unrelated DNA molecules at the DSB sites. In this thesis, integrase‐deficient lentiviral vectors (IDLV) were introduced into target cells and became stably incorporated into the genome at radiation‐induced DSB sites. The integration sites were subsequently amplified and identified by LAM‐PCR and sequencing. In total, more than 20,000 DSB sites in irradiated and expanded cancer cell lines and primary fibroblasts were obtained and compared to naturally‐occurring and doxorubicin‐induced DSB. Using this DSB data set, the DSB distribution with respect to transcriptional activity, chromatin structures, as well as gene function and networks was analyzed. In radiation‐survivor cells the distribution of DSB was non‐random. DSB sites appeared more frequently in genes with specific functions, in genes regulated by specific regulatory networks and in accessible genomic regions. Radiation‐induced DSB frequently accumulated in genomic hotspots, which were identified at eu‐ and heterochromatin boundaries as well as near oncogenes, tumor‐suppressors and enhancer elements. The results presented in this thesis indicate that radiation‐induced genomic mutations preferably occur or are selected for specific genomic regions in surviving cells. These genomic hotspots of induced DNA damage may increase the likelihood of radioresistance mechanisms and therapy‐induced carcinogenesis.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kalle, Prof. Dr. Christof von
Date of thesis defense: 16 April 2015
Date Deposited: 01 Jun 2015 11:00
Date: 2016
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords: DNA Doppelstrangbruch, Genomische Instabilität, Bestrahlung
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