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Development of Novel Reagents for the Selective Enrichment of Vascular Accessible Proteins and the Identification of Disease-Specific Biomarkers

Hanke, Sabrina Annette

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Abstract

A promising approach for the development of novel therapeutics with fewer side effects in healthy tissues is the targeted delivery of bioactive molecules directly to the site of disease. The prerequisite is the identification of a robust, disease-specific biomarker, targetable either with monoclonal antibodies interfering with the target’s biological function or with antibody-drug conjugates delivering a therapeutic payload such as a cytotoxic drug. Hence, the target molecules of interest have to be vascular-accessible and are therefore located on the surface of diseased cells, on newly formed blood vessels or in the perivascular extracellular matrix. Proteomic approaches for the identification of novel biomarkers have to deal with (i) the high dynamic range of the proteome over at least seven orders of magnitude, (ii) the low abundance of the highly diverse plasma membrane proteome fraction, as well as with (iii) the hydrophobic character of membrane proteins. The proteins of interest are therefore often under-represented in mass spectrometric datasets of full proteome samples and cannot be stably quantified. One avenue towards the enrichment of the vascular-accessible surface proteome fraction prior to mass spectrometric analysis is the covalent modification of the target proteins with a membrane-impermeable ester-derivative of biotin, followed by streptavidin-based affinity capturing. The biotinylation of potential biomarkers is fast and efficient and can be performed by in vitro labelling of cells, via in vivo perfusion of mice or ex vivo using surgically resected tissue material.

The work in this thesis focused on the synthesis and multi-step validation of two novel, multiply-charged peptide-based as well as of two novel heparin-based biotinylation reagents. Furthermore, two alkyne-tagged reagents for bioorthogonal click-chemistry based enrichment were designed. The reagents’ reactivity was assessed by coupling to BSA in different ratios and analysis with linear MALDI mass spectrometry. Subsequent validation was performed in vitro on HeLa cells and in vivo via perfusion of healthy NSG mice. Biotinylation efficacy was examined using FACS analysis, ELISA and Western Blot of cell and tissue samples. Cell surface or perivascular biotinylation was visualized by confocal laser scanning microscopy. Mass spectrometric analyses of the accessible proteome fractions were performed in comparison to the commercial reagents Sulfo-NHS-LC-biotin and NHS-PEG12-biotin and PBS- or non-treated negative controls on biotinylated HeLa cells and kidney or liver tissue using a MALDI TOF/TOF™ 5800 system (AB SCIEX). Mass spectrometric data were analysed in terms of identified protein and proteotypic peptide numbers as well as of protein localization. Relative quantification based on MS1 signal intensities was performed using the in-house developed software MSQBAT. SRM-analysis of some medium- and low-abundant cell surface and extracellular matrix proteins was performed in comparison to full proteome samples on a QTRAP® 6500 system (AB SCIEX).

The properties of any biotinylation reagent are determined by the linker between the biotin residue for affinity purification and the reactive group for protein coupling. Increase in size and polarity influences the reagents’ selectivity and reactivity. Site-specific activation of the novel peptide-based biotinylation reagents could significantly improve the reactivity in comparison to non-specifically activated NHS-β-Ala-(L-Asp)3-biotin published by Strassberger et al. in 2010. Alkyne-tagged reagents revealed comparable reactivity to the biotinylation reagents resulting from the similarity of the peptide-based linkers. Due to their enormous size and the increased steric hindrance, heparin-based reagents are less reactive than the smaller peptide-based and commercial reagents. The reactivity difference is also mirrored in the mass spectrometric datasets. A total of 1574 proteins could be identified within the in vitro analysis. The proof-of-principle study could demonstrate the stable identification of a 38-49% fraction of plasma membrane or extracellular matrix annotated proteins with the peptide-based reagents. 1965 proteins were found in the kidney dataset with a comparable fraction of 40-45% surface annotated proteins. Within the liver dataset, 1531 proteins could be identified with a slightly increased intracellular protein fraction (27-34% surface proteome fraction). Reasons for the typical background proteome identification in all samples were further assessed by different sample preparation strategies within this thesis. In short, it can be stated, that the success of biomarker studies with biotinylation reagents are dependent of the vascularisation of the target tissue to enable high biotinylation rates as well of elaborated sample preparation protocols: For example, delipidation is crucial for the work with tissue samples. A slight reactivity decrease of the novel peptide-based reagents compared to commercial Sulfo-NHS-LC-biotin was detected due to the sterically more hindered peptide linker. Nevertheless, the enrichment of the targeted surface proteome is very stable: 40% of the quantified proteins are more than 2-fold up- or down-regulated in comparable fractions between the peptide-based and the commercial reagent (kidney dataset). The number of identified proteotypic peptides per plasma membrane or extracellular matrix annotated protein is significantly increased compared to the negative controls and to the intracellular proteome fraction, which is the basis for enabling a stable protein quantification.

The mass spectrometric studies revealed that the novel peptide-based reagents provide a reliable technology platform for the enrichment of vascular accessible proteins: Plasma membrane or extracellular matrix annotated biomarker candidates can be stably identified and quantified based on high numbers of proteotypic peptides. Furthermore, stable SRM-based quantification of medium- and low-abundant targets is enabled.

Translation of abstract (German)

Ein vielversprechender Ansatz zur Entwicklung von neuen Medikamenten mit weniger Nebenwirkungen in gesundem Gewebe besteht im zielgerichteten Transport von bioaktiven Molekülen direkt an den Krankheitsherd. Die Entwicklung solcher innovativer Medikamente setzt zunächst die Identifizierung eines robusten und spezifischen Biomarkers als Zielstruktur im erkrankten Gewebe voraus. Diese kann im Folgenden mit monoklonalen Antikörpern, die die biologische Funktion des Biomarkers beeinträchtigen, oder mit an Antikörpern gekoppelten Medikamenten angegriffen werden. Dabei ist die Analyse des vaskulär erreichbaren Oberflächenproteoms aufgrund der leichten Zugänglichkeit durch den Blutstrom von großem Interesse: Potentielle Zielstrukturen sind auf den Zelloberflächen im erkrankten Gewebe, auf der Oberfläche neugebildeter Blutgefäße sowie in der umgebenden extrazellulären Matrix zu suchen. Die Identifizierung neuer Protein-Biomarker durch massenspektrometrische Analyse wird zum einen durch die hohe Komplexität des Proteoms mit einer Abundanz-Spanne von mindestens sieben Größenordnungen erschwert. Oberflächenproteine sind hochdivers in Struktur und Funktion, aber oftmals nur in niedriger Kopienzahl exprimiert. Des weiteren erschwert der hydrophobe Charakter der Membranproteine die Analyse. Aus diesen Gründen sind potentielle Biomarker in Vollproteom-Datensätzen meist unterrepräsentiert und können daher auch nicht stabil quantifiziert werden. Eine Möglichkeit zur Anreicherung der vaskulär erreichbaren Zielstrukturen vor der massenspektrometrischen Analyse ist deren kovalente Modifizierung mit einem Membran-impermeablen Biotin-Ester-Derivat, welches mit Hilfe von Streptavidin-Sepharose affinitätsbasiert angereichert werden kann. Die Biotinylierungsreaktion verläuft schnell und quantitativ, was neben dem Markieren von Zellen in vitro auch die in vivo Perfusion von Mäusen sowie die ex vivo Perfusion von humanem, operativ entferntem Gewebe ermöglicht.

Die Entwicklung und Validierung zweier mehrfach geladener Peptid- und zweier Heparin-basierter Biotinylierungsreagenzien zur selektiven Anreicherung von vaskulär erreichbaren Zelloberflächenproteinen steht im Fokus dieser Doktorarbeit. Darüberhinaus wurden zwei Alkin-modifizierte Reagenzien für bioorthogonale Anreicherung über eine Click-Reaktion synthetisiert. Die Reaktivität der Reagenzien wurde durch Reaktion mit BSA in verschiedenen molaren Verhältnissen und Analyse des modifizierten Proteins durch lineare MALDI Massenspektrometrie untersucht. Weitere Validierungsexperimente wurden mit der Zelllinie HeLa sowie mit in vivo perfundierten, gesunden NSG-Mäusen durchgeführt. Die Effizienz der Biotinylierung von Zell- und Gewebeproben wurde hierbei durch Durchflusszytometrie (FACS), ELISA und Western Blot Analyse bestimmt. Die Biotinylierung der Zelloberflächen bzw. die perivaskuläre Markierung mit den Reagenzien wurde mittels konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie untersucht. Die massenspektrometrische Analyse der angereicherten Proteinfraktion wurde im Vergleich zu den kommerziellen Reagenzien Sulfo-NHS-LC-biotin und NHS-PEG12-biotin sowie zu PBS- oder unbehandelten Negativkontrollen durchgeführt. Die angereicherten Proteinlysate von biotinylierten HeLa-Zellen sowie von Nieren- und Lebergewebe von perfundierten Mäusen wurden dabei auf einem MALDI TOF/TOF™ 5800 System (AB SCIEX) analysiert. Die anschließende Datenanalyse konzentrierte sich auf die vergleichende Untersuchung der Anzahl der identifizierten Proteine und proteotypischen Peptide, sowie deren subzelluläre Lokalisierung. Eine relative Quantifizierung wurde basierend auf den MS1 Signalintensitäten mit Hilfe der Labor-eigenen Software MSQBAT durchgeführt. Mittels SRM-Analyse wurden darüber hinaus einige Oberflächenproteine mit niedriger oder mittlerer Abundanz im Vergleich zu nicht angereicherten Vollproteom- Proben auf einem QTRAP® 6500 System (AB SCIEX) quantifiziert.

Die Eigenschaften von Biotinylierungsreagenzien werden durch den Linker zwischen dem Biotinrest und der reaktiven Gruppe zur Modifizierung der Zielproteine bestimmt. Eine Vergrößerung des Reagenz oder eine Veränderung der Polarität beeinflussen die Reaktivität und die Selektivität. Die regioselektive Aktivierung der neuen Peptid-basierten Reagenzien erhöht die Reaktivität im Vergleich zum unspezifisch aktivierten NHS-β-Ala-(L-Asp)3-biotin (Strassberger et al., 2010) signifikant. Die alkinmodifierten Peptid-Reagenzien weisen eine ähnliche Reaktivität wie die strukturell verwandten Biotinylierungsreagenzien auf. Aufgrund ihrer enormen Größe und der daraus resultierenden sterischen Hinderung sind die Heparin-basierten Reagenzien weniger reaktiv als die wesentlich kleineren Peptid-basierten oder die kommerziell erhältlichen Reagenzien. Diese Reaktivitätsdifferenz spiegelt sich auch in der massenspektrometrischen Analyse wider. Im Gesamten konnten in der in vitro Analyse 1574 Proteine identifiziert werden. Das Pilotexperiment konnte belegen, dass die Peptid-basierten Biotinylierungsreagenzien die stabile Identifizierung einer 38-49% großen Fraktion von Proteinen ermöglicht, die in der Plasmamembran oder der extrazellulären Matrix lokalisiert sind. Im Nieren-Datensatz wurden 1965 Proteine mit einer vergleichbaren Fraktion an Oberflächenproteinen von 40-45% gefunden. Die Identifizierung intrazellulärer Proteine war im Leber-Datensatz leicht erhöht: 1531 Proteine mit einem Oberflächenproteomanteil von 27-34%. Die für solche Datensätze typische Identifizierung eines intrazellulären Hintergrundproteoms wurde in dieser Arbeit mittels verschiedener Probenaufarbeitungs-Strategien ebenfalls untersucht. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Erfolg von Biomarker-Identifizierungsstudien zum einen von der Vaskularisierung des Zielgewebes abhängig ist, um hohe Biotinylierungsraten zu ermöglichen, und zum anderen von verfeinerten Protokollen zur Probenpräparation: Beispielsweise erwies sich die Delipidierung als wesentlich für die Arbeit mit Gewebeproben. Trotz der verminderten Reaktivität der Peptid-basierten Reagenzien gegenüber des kommerziellen Sulfo-NHS-LC-biotin durch den sterisch anspruchsvolleren Peptidlinker verläuft die Anreicherung des Zielproteoms sehr stabil: 40% der quantifizierten Proteine sind mehr als 2-fach reguliert, und zwar zu gleichen Teilen zwischen Peptid- und kommerziellem Reagenz (Nieren Datensatz). Die Anzahl der identifizierten proteotypischen Peptide von Plasmamembran oder extrazellulärer Matrix-annotieren Proteinen ist im Vergleich zu den Negativkontrollen und der intrazellulären Proteinfraktion signifikant erhöht - die Basis für jede erfolgreiche Quantifizierung.

Die massenspektrometrischen Validierungsstudien konnten zeigen, dass die neuen Peptid-basierten Biotinylierungsreagenzien eine verlässliche Technologie zur Anreicherung vaskulär erreichbarer Proteine darstellen: Plasmamembran- oder extrazelluläre Matrix-Proteine konnten basierend auf einer Vielzahl von proteotypischen Peptiden stabil identifiziert und quantifiziert werden. Darüber hinaus ermöglichen die neuen Reagenzien auch eine robuste SRM-basierte Quantifizierung von Zielproteinen mit mittlerer bis niedriger Abundanz.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rösli, Dr. Christoph
Date of thesis defense: 28 September 2015
Date Deposited: 16 Oct 2015 05:30
Date: 2015
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteomics, Massenspektrometrie, Konjugate
Uncontrolled Keywords: Proteomics, Bioconjugation, Mass Spectrometry
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