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The roles of sphingosine in calcium signaling and Niemann-Pick disease type C

Höglinger, Doris

German Title: Sphingosin in intrazellulärer Signalübertragung und Niemann-Pick Typ C

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Abstract

Although several lipids have been shown to participate in intracellular signal transduction events and to influence central cellular processes, the bioactive actions of most lipids remain unexplored. This lack of knowledge is mainly due to a shortage of tools to manipulate lipid levels within living cells in a non-invasive way and to identify new protein interactors of single lipid species. This work presents the development of two methods to overcome these drawbacks applied to sphingosine (Sph). The origin of calcium signaling properties of Sph and its involvement in the pathophysiological development of the lysosomal storage disease Niemann-Pick type C (NPC) are reported. First, ‘caged’ variants of sphingosine were synthesized which enable the precise elevation of Sph levels in single living cells within seconds using light. This acute increase in Sph concentration led to an immediate release of lysosomal calcium through the actions of the two-pore channel 1 (TPC1). In cells derived from NPC patients, an accumulation of Sph in the endolysosomal compartments was visualized for the first time. Additionally, NPC cells exhibited reduced calcium signals upon Sph uncaging, indicating that Sph accumulation is upstream of a calcium defect in this disease. Sph-induced calcium release also initiated the nuclear translocation of transcription factor EB, which positively regulates the expression of autophagic and lysosomal biogenesis genes, further underlining the importance of lysosomal calcium release in direct lysosome-to-nucleus signaling pathways. In order to capture Sph-interacting proteins, a trifunctional Sph (TFS) was developed. TFS facilitates the release and immediate crosslinking of Sph to its interacting partners within the living cell. Mass-spectrometric analyses identified known Sph-binding proteins such as the ceramide synthase, as well as novel putative Sph-interactors. The general applicability of this method was proven by using trifunctional diacylglycerol as well as a trifunctional fatty acid. TFS was further employed in investigations of the subcellular localization and transport of Sph through the cell. NPC patient fibroblasts showed a striking accumulation of Sph in late endosomes and lysosomes. Sph transport out of these vesicles was severely hindered in the NPC condition. The kinetics of Sph efflux correlated with the severity of symptoms in different NPC patients, so this assay could potentially be used for monitoring and prognosis of NPC disease severity.

Translation of abstract (German)

Nur einige von tausenden Lipidspezies in eukaryotischen Zellen sind bereits bekannte bioaktive Lipide, welche in komplexe intrazelluläre Signalübertragungsnetzwerke eingebunden sind. Viele andere Lipide haben noch unerforschte Auswirkungen auf zelluläre Prozesse. Mögliche Gründe dafür sind die Schwierigkeiten, die Konzentration dieser Lipide in lebenden Zellen durch nicht-invasive Methoden zu manipulieren oder deren Wechselwirkungen mit Lipid-bindenden Proteinen zu erforschen. In dieser Arbeit werden Methoden zur spezifischen Freisetzung von Lipiden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung sowie zur Proteom-weiten Identifizierung von Lipid-bindenden Proteinen in lebenden Zellen vorgestellt. Als Modelllipid diente Sphingosin (Sph), ein einkettiges Lipid aus der Gruppe der Sphingolipide, welches eine bedeutende, allerdings noch nicht näher definierte Rolle in der Pathologie der lysosomalen Erbkrankheit Niemann-Pick Typ C (NPC) spielt. Die Modifizierung von Sph mit verschiedenen photospaltbaren Schutzgruppen lieferte inerte Sph-Vorläufer, welche nach Zugabe zu verschiedenen Zelllinien kein Signal auslösten. Erst durch Photospaltung direkt am Mikroskop erhöhte sich die Konzentration von Sph in einzelnen lebenden Zellen innerhalb von Sekunden. Dieser Anstieg löste die Freisetzung von Kalzium aus den lysosomalen Kalzium-Speichern aus, welche durch den Kalzium-Kanal TPC1 gesteuert wurde. Untersuchungen von NPC-Patientenzellen zeigten sowohl ein reduziertes lysosomales Kalzium-Signal als auch erhöhte Sph Konzentrationen in Endosomen und Lysosomen, welches den Schluss nahelegt, dass die Akkumulation von Sph in diesen Zellen zur Senkung des lysosomalen Kalziumspiegels beiträgt und somit die Fusion von Endosomen und Lysosomen erschwert. Die Bedeutung des Sph-induzierten Kalzium-Signals wurde durch die nachfolgende nukleare Translokation des Transkriptionsfaktors EB unterstrichen. Die Entwicklung eines trifunktionalen Sph (TFS) ermöglichte die Freisetzung und sofortige Quervernetzung von Sph mit wechselwirkenden Proteinen in lebenden Zellen. Nachfolgende massenspektrometrische Analysen identifizierten bereits bekannte als auch potenziell neue Sph-bindende Proteine und zeigten die Anwendbarkeit dieses Konzepts auf andere Signallipide. TFS wurde auch benutzt, um die Lokalisation von Sph in NPC-Patientenzellen zu untersuchen. Eine deutliche Ansammlung von Sph in Endosomen und Lysosomen sowie ein erschwerter Transport von Sph aus diesen Organellen wurde sichtbar. Die Kinetik des Sph-Transports korrelierte direkt mit der Schwere der Smyptome dieser NPC-Patienten. Dieser Assay könnte somit in Zukunft zur Beobachtung und Prognose von NPC-Patienten verwendet werden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Felix
Date of thesis defense: 5 October 2015
Date Deposited: 25 Nov 2015 13:34
Date: 2016
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
570 Life sciences
Controlled Keywords: Sphingolipids, Lysosomes
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