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In vitro Zellkulturmodelle der Blut-Hirn-Schranke zur Untersuchung der Permeation und P-Glycoprotein-Interaktion von Arzneistoffen

Bauer, Björn

English Title: In vitro cell culture models of the blood-brain barrier for studying permeation and p-glycoprotein-interaction of drugs

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PDF, German
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Abstract

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit waren 1) die Isolierung, Kultivierung und Charakterisie-rung cerebraler Kapillarendothelzellen als Modellzellen für Zellkulturmodelle der Blut-Hirn-Schranke, 2) die Charakterisierung eines in vitro Permeationsmodells der Blut-Hirn-Schranke sowie 3) die Entwicklung eines Screening-Modells zur Untersuchung von Arzneistoff-Interaktionen mit P-Glycoprotein (P-gp). Die Zellisolierung erfolgte nach einer rein enzymatischen Methode aus Schweinehirn. Die Zellen zeigten gutes Wachstum und bildeten konfluente Monolayer, was mit Aktinfärbungen belegt wurde. Immunfärbungen des von-Willebrand-Faktors bestätigten den endothelialen Charakter der Zellen. Immunfärbungen des ABC-Transporters Mrp2 waren negativ. Die Ex-pression von P-Glycoprotein konnte dagegen nachgewiesen werden. Die Charakterisierung des in vitro Permeationsmodells der Blut-Hirn-Schranke erfolgte an-hand von Permeationsversuchen. Aufgrund der Untersuchungen wurden verschiedene Ein-flussfaktoren charakterisiert und standardisiert. Zwischen passiver parazellulärer bzw. transzellulärer Permeation, erleichterter Diffusion und aktivem Transport durch den ABC-Transporter P-Glycoprotein konnte differenziert werden. Zur Untersuchung von Arzneistoff-Interaktionen mit P-Glycoprotein wurden der Calcein-AM-MDR-Assay und der Calcein-AM-Kinetik-Assay. Mit dem Calcein-AM-MDR-Assay wurden Validierungssubstanzen richtig identifiziert und gut differenziert. Aufgrund der Untersuchun-gen mit dem Calcein-AM-Kinetik-Assay wurden Nicardipin und PSC-833 als non-kompetitive P-gp-Inhibitoren klassifiziert. Ritonavir, Taxol und Vinblastin wurden als kompetitive P-gp-Substrate eingestuft. Die Ergebnisse zeigen, dass das in vitro Permeationsmodell der Blut-Hirn-Schranke als indu-strietaugliches Permeations-Screening-Modell verwendet werden kann, und dass der Cal-cein-AM-MDR- und Calcein-AM-Kinetik-Assay gute Screening-Modelle zur Untersuchung von Arzneistoff-P-gp-Interaktionen darstellen.

Translation of abstract (English)

The aim of the present work was 1) the isolation, cultivation and characterization of porcine brain capillary endothelial cells (PBCEC) for cell culture models of the blood-brain barrier, 2) the characterization of a permeation model of the blood-brain barrier as a screening model for drugs and 3) the development of a screening model to determine drug interactions with p-glycoprotein (p-gp). For isolating PBCEC from porcine brain, an enzymatic method was used. Good growth of the cells was demonstrated by actin-staining of confluent cell monolayers. Immunostaining of von-Willebrand-factor demonstrated the endothelial character of cultured PBCEC. Immuno-staining of Mrp2 was negative. Thereagainst, the expression of p-glycoprotein could been demonstrated. The in vitro permeation model of the blood-brain barrier was characterized by permeation studies with paracellular-markers. Factors influencing the outcome of the model were identi-fied and standardized. Passive paracellular and transcellular permeation, facilitated diffusion and active transport by the ABC-transporter p-glycoprotein could been distinguished. In order to study drug interactions with p-glycoprotein, the calcein-AM-MDR-assay and the calcein-AM-kinetic-assay were established. Using the calcein-AM-MDR-assay, drugs could be identified as p-gp-modulators and non-modulators. A good differentiation between strong, moderate and weak p-gp-modulators as well as structurally similar compounds was obser-ved. Using the calcein-AM-kinetic-assay, nicardipin and psc-833 were classified as non-competitive p-gp-inhibitors. Ritonavir, taxol and vinblastine were classified as competitive p-gp-substrates. The resultus show that the in vitro permeation model of the blood-brain barrier can be used as a permeation-screening-model for drugs. The calcein-AM-MDR-assay and the calcein-AM-kinetic-assay can be used as screening-models to determine drug interactions with p-glycoprotein.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Fricker, Prof. Dr. Gert
Date of thesis defense: 30. April 2002
Date Deposited: 24. Jun 2002 00:00
Date: 2002
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Blut-Hirn-Schranke
Uncontrolled Keywords: Zellkulturmodell , P-Glycoprotein , Permeationblood-brain barrier , cell culture model , p-glycoprotein , permeation
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