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Quantitative Untersuchung der Verteilung, Mobilität und Bindung von fluoreszenzmarkierten Histonen in vitro und in vivo mit Fluoreszenzfluktuationsmikroskopie

Weidemann, Thomas

English Title: Quantitative investigation of distribution, mobility, and binding of fluorescently labeled histones with fluorescence fluctuation microscopy

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PDF, German
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Abstract

Der Bindungszustand von Histonen an DNA in vitro und in vivo sowie ihre Verteilung und Mobilität in der Zelle werden mit Hilfe von Fluoreszenz untersucht. Dazu werden Histonproteine sowohl synthetisch mit organischen Farbstoffen konjugiert als auch die Fusionsproteine von H2B und H1 mit EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) in HeLa-Zellen exprimiert. Die Messungen erfolgen mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und kontinuierlichem Bleichen der Fluoreszenz (CP) im gleichen optischen Aufbau, dem Fluoreszenzfluktuationsmikroskop (FFM). Ein theoretischer Formalismus für FCS wird auf zwei Anwendungsbereiche erweitert: Erstens die allgemeine Analyse bimolekularer Bindungsreaktionen über Zwei-Farben-FCS und zweitens die Bestimmung von Anzahl und Fluoreszenzausbeute der gebundenen Farbstoffe mit Ein-Farben-FCS. Die Theorie wird im Experiment an isolierten, markierten Nukleosomenketten angewendet. Bei sehr niedriger Ionenstärke kann zwischen den Nukleosomen ein geringfügiger Austausch der Histone nachgewiesen werden. In lebenden Zellen wird die Verteilung und Mobilität einer H2B-EYFP-exprimierenden Zellinie untersucht. Es wird ein Ansatz aufgezeigt, wie über FCS-Messungen im Cytoplasma die im konfokalen Bild aufgezeichneten Intensitäten in absolute Konzentrationen von Fluorophoren umgerechnet werden können. Über Bleichmessungen wird ein Reservoir von frei diffundierendem H2B-EYFP von den in der Chromatinfiber immobilisierten Komponenten diskriminiert. Über eine in vitro bestimmte Einbaurate der Fusionsproteine in die Nukleosomen können aus den konfokalen Bildern Nukleosomendichtekarten für HeLa-Zellkerne erstellt werden. Eine statistische Auswertung der Konzentrationen erfolgt mit Histogrammen und ergibt mittlere Nukleosomendichten in der Interphase zwischen 110 und 140 µM, während in mitotischen Chromosomen Maximalwerte bis zu 450 µM gemessen werden.

Translation of abstract (English)

The binding state of histones to DNA in vitro and in vivo and their distribution and mobility in the cell are investigated with fluorescence. For this purpose histone proteins are conjugated synthetically with organic dyes and fusion proteins of H2B and H1 with EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) are expressed in HeLa-cells. The methods used are fluorescence correlation spectroscopy (FCS), confocal laser scanning microscopy (CLSM), and continuous fluorescence photobleaching (CP) in the same optical setup, the fluorescence fluctuation microscope (FFM). A theoretical framework for FCS is extended for two cases: a general analysis of bimolecular binding reactions with two-colour FCS and the determination of the number of bound dyes and their fluorescence yield with one-colour FCS. The theory is used for studying isolated nucleosomes in vitro. The results show that a small fraction of histones exchages between the nucleosome chains at very low ionic strength. In living cells, the distribution and mobility of H2B-EYFP is characterised in detail. With FCS, concentration and brightness of nascent molecules are measured in the cytoplasm. A procedure is presented with which intensity values of confocal images can be converted into absolute concentrations of fluorophores. With CP, a mobile pool of fluorescent H2B-EYFP in the nucleoplasm can be distinguished from an immobilised fraction assembled into chromatin. Together with the fraction of EYFP-tagged nucleosomes determined in vitro, this allows to transform confocal images into nucleosome density maps. A histogram analysis of the nucleosome densities shows mean values between 110 and 140 µM in interphase and maximum values of 450 µM in mitotic chromosomes. Different states of condensation are discussed. Compared to H2B-EYFP the binding of H1-EYFP is dynamic. By means of continuous photobleaching (CP) a residence time of 16 ± 4 s for H1 at its binding sites in chromatin is determined.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Langowski, Prof. Jörg
Date of thesis defense: 29. May 2002
Date Deposited: 24. Jun 2002 00:00
Date: 2002
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Chromatin, Histone, Zellkern, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, Konfokale Mikroskopie
Uncontrolled Keywords: Fluoreszenzmarkierung , Rezeptor-Liganden-Bindung , Zwei-Farben-FCS , intrazelluläre DiffusionChromatin , Histones , Cell Nucleus , Fluorescence Correlation Spectroscopy , Confocal Laser Scanning Microscopy
Additional Information: Teile in: Analysis of Ligand Binding by Two-Colour Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy, Single Mol. 3(1), p. 49-61 (2002)
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