Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Correlative light and electron microscopy: new strategies for improved throughput and targeting precision

Steyer, Anna

German Title: Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie: Neue Strategien für höheren Durchsatz und verbesserte Zielgenauigkeit

[thumbnail of Steyer_Disertation_UB.pdf]
Preview
PDF, English
Download (15MB) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the DOI, URN or the persistent URL below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

The need for quantitative analysis is crucial when studying fundamental mechanisms in cell biology. Common assays consist of interfering with a system via protein knockdowns or drug treatments. These very often lead to important response variability that is generally addressed by analyzing large populations. Whilst the imaging throughput in light microscopy (LM) is high enough for such large screens, electron microscopy (EM) still lags behind and is not adapted to collect large amounts of data from highly heterogeneous cell populations. Nevertheless, EM is the only technique that offers high-resolution imaging of the entire subcellular context. Correlative light and electron microscopy (CLEM) has made it possible to look at rare events or addressing heterogeneous populations. Our goal is to develop new strategies in CLEM. More specifically, we aim at automatizing the processes of screening large cell populations (living cells or pre-fixed), identifying the sub-populations of interest by LM, targeting these by EM and measuring the key components of the subcellular organization. New 3D-EM techniques like focused ion beam - scanning electron microscopy (FIB-SEM) enable a high degree of automation for the acquisition of high-resolution, full cell datasets. So far, this has only been applied to individual target volumes, often isotropic and has not been designed to acquire multiple regions of interest. The ability to acquire full cells with up to 5 nm x 5 nm x 5 nm voxel size (x, y referring to pixel size, z referring to slice thickness), leads to the accumulation of large datasets. Their analysis involves tedious manual segmentation or so far not well established automated segmentation algorithms. To enable the analysis and quantification of an extensive amount of data, we decided to explore the potential of stereology protocols in combination with automated acquisition in the FIB-SEM. Instead of isotropic datasets, a few evenly spaced sections are used to quantify subcellular structures. Our strategy therefore combines CLEM, 3D-EM and stereology to collect and analyze large amounts of cells selected based on their phenotype as visible by fluorescence microscopy. We demonstrate the power of the approach in a systematic screen of the Golgi apparatus morphology upon alteration of the expression of 10 proteins, plus negative and positive control. In parallel to this core project, we demonstrate the power of combining correlative approaches with 3D-EM for the detailed structural analysis of fundamental cell biology events during cell division and also for the understanding on complex physiological transitions in a multicellular model organism.

Translation of abstract (German)

Der Bedarf an quantitativer Analyse ist entscheidend um die grundlegenden Mechanismen in der Zellbiologie und angrenzenden Disziplinen zu verstehen. Gebräuchliche Analysen bei denen in ein biologisches Testsystem mit Hilfe von Protein-Knockdown oder mit Behandlung von chemischen Substanzen eingegriffen wird, sorgen häufig für sehr unterschiedliche Phänotypen. Diese Variabilität wird meistens an Hand der Analyse von großen Populationen studiert. Während die Bildgebung in der Lichtmikroskopie (LM) einen Durchsatz erreicht, der ausreichend ist um große Populationen zu analysieren, hinkt die Elektronenmikroskopie (EM) noch immer hinterher und ist nicht dafür angepasst viele Daten von sehr heterogenen Zellpopulationen zu akquirieren. Dennoch, EM ist die einzige Technik, die hochauflösende Bilder vom gesamten subzellulären Kontext aufnehmen kann. Die Kombination von Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) hat es möglich gemacht seltene Ereignisse oder heterogene Populationen anzuschauen. Unser Ziel ist es, neue CLEM Strategien zu entwickeln. Im Einzelnen wollen wir den Screeningprozess großer Zellpopulationen um Sub-Populationen zu finden, das Wiederfinden im EM und das Quantifizieren von Schlüsselkomponenten der subzellulären Strukturen, automatisieren (lebende oder fixierte Zellen). Neue 3D-EM Techniken wie Rasterelektronenmikroskopie mit fokussiertem Ionenstrahl (FIB-SEM) machen es möglich ein hohes Niveau an Automatisierung für die Akquisition von hochauflösenden, die ganze Zelle umspannenden Datensätzen, zu erreichen. Bis jetzt wurde dies nur bei einzelnen Zielvolumen vorgenommen, meistens isotropisch und nicht dafür vorgesehen, dass mehrere Regionen aufgenommen werden. Die Fähigkeit ganze Zellen mit 5 nm x 5 nm x 5 nm Voxelgröße (x/y bezieht sich auf die Pixelgröße, z bezieht sich auf die Schnittdicke) aufzunehmen, führt zu einer Akkumulation von großen Datensätzen. Deren Analyse involviert mühsame manuelle Segmentierung und Quantifizierung von umfangreichen Datenmengen. Wir haben uns entschlossen die Möglichkeit zu untersuchen, stereologische Protokolle in Kombination mit einer automatisierten Akquisition im FIB-SEM zu verwenden. Anstelle von isotropischen Datensätzen werden einige wenige gleichmäßig verteilte Schnitte verwendet um sub-zelluläre Strukturen zu quantifizieren. Unsere Strategie verbindet deshalb CLEM, 3D-EM und Stereologie um große Mengen an Daten von ausgewählten Zellen (phänotypisch sichtbar im Fluoreszenzmikroskop) aufzunehmen und zu analysieren. Wir demonstrieren die Stärke unseres Ansatzes in einem systematischen Screen der Morphologie des Golgi Apparates nach der Veränderung der Expression von 10 Proteinen, inklusive Negativ- und Positivkontrolle. Parallel zu diesem Kernprojekt demonstrieren wir die Möglichkeiten die korrelative Ansätze und 3D-EM bieten, um detaillierte Strukturanalysen von fundamentalen zellbiologischen Prozessen während der Zellteilung und komplexe Veränderungen in einem multizellulären Modellorganismus zu verstehen.

Document type: Dissertation
Supervisor: Gavin, Dr. Anne-Claude
Date of thesis defense: 30 March 2017
Date Deposited: 19 Jun 2018 10:06
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
DDC-classification: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
Controlled Keywords: Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoDINI certificate 2013Logo der Open-Archives-Initiative