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Epigenetische und funktionelle Analyse des Tumorsuppressorkandidaten 3 (TUSC3) im kolorektalen Karzinom

Höde, Patrick

English Title: Epigenetic and functional analysis of tumor supressor candidate 3 (TUSC3) in colorectal cancer

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Abstract

Das kolorektale Karzinom (KRK) stellt geschlechterübergreifend weltweit die dritthäufigste Tumorentität dar und ist für einen bedeutenden Anteil der Malignom-assoziierten Morbidität und Mortalität verantwortlich. Kolorektale Karzinome entstehen in den meisten Fällen sporadisch durch Mutation unterschiedlicher Gene. Die Behandlung eines Kolonkarzinoms ist von unterschiedlichen Gegebenheiten abhängig, hauptsächlich von der Art und dem Stadium des Tumors sowie von möglichen Begleiterkrankungen. Anhand dieser verschiedenen Parameter wird ermittelt, welche Behandlung die angemessenste für den Patienten ist. Dabei gibt es unterschiedliche Möglichkeiten, wie die Optionen einer Operation, einer Chemotherapie, einer Bestrahlung, einer Immuntherapie oder einer zielgerichteten Medikation. Zielgerichtete Therapien zielen auf tumorspezifische Merkmale der Karzinomzellen ab und versprechen eine Steigerung des Ansprechens der Therapie bei Reduzierung der Nebenwirkungen. Ein Ansatzpunkt ist dabei der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR). Aktivierende Mutationen von EGF-abhängigen Signalkaskaden stellen allerdings ein zentrales Problem in der Therapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms dar, da es durch diese Mutationen immer wieder zu einem Therapieversagen kommt. Tumormarker, die ein Therapieansprechen vorhersagen, sind daher im Rahmen der Therapieplanung von immenser Bedeutung. Diese Marker sind messbare Parameter biologischer Prozesse, die es ermöglichen, diagnostische oder prognostische Aussagen zu treffen. Tumormarker können einen Hinweis auf einen Tumor geben, da sie entweder ausschließlich bei einer Tumorerkrankung vorliegen oder im Vergleich zu einem gesunden Menschen in verstärktem Maße exprimiert werden. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Identifikation möglicher Mechanismen, die dabei helfen können, eben jene Resistenz gegenüber zielgerichteten Therapien zu durchbrechen. Das Tumorsuppressorgen TUSC3 könnte ein solcher Marker sein. TUSC3 ist eine Untereinheit des Oligosaccharyltransferase (OST)-Komplexes an der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER). Eine N-Glykosylierung von Wachstumsfaktoren (GFRs), wie dem EGF-Rezeptor, garantiert eine korrekte Insertion von Transmembranproteinen in die ER-Membran sowie den Transport vom ER zum Golgi und die stabile Einlagerung an der Plasmamembran. Da TUSC3 an der N-Glykosylierung beteiligt ist und EGFR die N-Glykosylierung für seine normale Funktion benötigt, wurde die Hypothese formuliert, dass TUSC3 entweder aufgrund einer Verringerung des Proteingehalts oder einer Reduktion der Aktivität von EGFR in KRK-Zellen den Zelltod fördert. Die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Familie bildet das erste Glied einer komplexen Signalübertragungskaskade. Diese ist unter anderem für die Zellproliferation, das Überleben, die Adhäsion, die Migration und die Differenzierung essentiell. Die EGFR-Familie kann aber auch von der Plasmamembran in den Kern transportiert werden. Ein starker Anstieg an nukleärem EGFR (n-EGFR) wurde im Tumorgewebe entdeckt. Diese Erhöhung an n-EGFR korreliert mit einem schlechten klinischen Verlauf bei verschiedenen Tumorentitäten. Das Hauptziel dieser Arbeit war die bis dato unbekannte epigenetische und VI funktionelle Analyse von TUSC3 im KRK. Ein spezifisches Ziel war die Analyse der epigenetischen Regulation durch den Methylierungsgrad des TUSC3-Promotors. Daher galt es zu Beginn der Arbeit, die Methylierung des TUSC3-Promotors zu validieren, indem der Methylierungsgrad der Gewebeproben der einzelnen Patienten bestimmt wurde. Des Weiteren wurde der Einfluss des Methylierungsgrades auf die Expression des endogenen TUSC3-Proteins in den Gewebeproben untersucht. Außerdem galt es, den Einfluss von TUSC3 auf das „downstream signaling“, die Phosphorylierung und das Aufkommen des EGFR in den verschiedenen Zellkompartimenten zu untersuchen. Für die spezielle Untersuchung des EGFR im Nukleus wurde eine subzelluläre Fraktionierung durchgeführt. Weiter sollte dabei auch der Einfluss auf die Signalweiterleitung zu einem späteren Zeitpunkt des Signalweges analysiert werden. Zusätzlich sollte die Möglichkeit einer Verbindung zwischen TUSC3 und der N-Glykosylierung mittels Tunicamycin untersucht werden. Ebenfalls erfolgte eine Überprüfung der Lokalisation von TUSC3 durch Immunfluoreszenzmarkierung mit Hilfe spezifischer Antikörper. Da zuvor gezeigt wurde, dass TUSC3 das EGFR-Signaling inhibiert, sollte im Anschluss der Blick auf spezifische Karzinommerkmale gerichtet werden. Zu diesen zählen unter anderem Änderungen der Proliferation und Apoptose. Beide werden dabei durch das EGFR-Signaling reguliert. Nicht zuletzt galt es die klinische Relevanz von TUSC3 zu prüfen. Insbesondere im Zusammenhang mit der Therapieresistenz gegenüber Cetuximab wurde der Frage nachgegangen, inwiefern TUSC3 möglicherweise als Tumormarker genutzt werden könnte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass TUSC3 im kolorektalen Karzinom am ER lokalisiert ist. So konnte ebenfalls bestätigt werden, dass TUSC3 im kolorektalen Karzinom, wie in anderen Tumorzelltypen, durch eine Hypermethylierung reguliert wird, indem die mRNA-Expression und damit auch die Proteinexpression von TUSC3 gesenkt wird. Als exemplarisches Zielprotein von TUSC3 konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation erstmals der EGFR identifiziert werden. Dieser Zusammenhang konnte bislang in keiner anderen Tumorentität nachgewiesen werden. Im Rahmen der Dissertation konnte gezeigt werden, dass TUSC3 die Aktivität von phosphoryliertem EGFR hemmt und die Akkumulation von nukleärem EGFR unterbindet. Außerdem wurde festgestellt, dass TUSC3 weiter stromabwärts des RAS/RAF/MEK/ERK- und des PI3K/PTEN/AKT/mTOR-Weges auch die Expression von p-AKT und p-ERK1/2 verringert, die in der Karzinomzelle die Proliferation fördern und die Apoptose verhindern. Eine zusätzliche Validierung erfolgte anhand des „Microarrays“, der ebenfalls einen Einfluss von TUSC3 auf Gene der N-Glykosylierung und der Apoptose darlegte. Die Untersuchung der Reporterplasmide ergab, dass TUSC3 vielfältige Tumor-relevante Signalwege hemmt, allen voran den WNT-Weg. TUSC3 könnte somit als potenzieller neuer Biomarker zur Früherkennung und zur Prognose von menschlichem KRK beitragen und einen wichtigen Ausgangspunkt für die frühe Analyse der Chemoresistenz bei der systemischen Behandlung von KRK darstellen.

Translation of abstract (English)

Colorectal carcinoma is the third most common tumor in the world and as such is responsible for a substantial proportion of malignoma associated morbidity and mortality. Colorectal carcinomas arise in most cases sporadically by mutation of different genes. In addition, a number of risk factors have been identified that can cause such mutations. The treatment of a colorectal carcinoma depends on different conditions, mainly on the type and stage of the tumor, as well as on possible accompanying diseases. These different parameters determine which treatment is the most appropriate for the patient. There are different options such as the options for surgery, chemotherapy, radiation therapy, immunotherapy or a targeted medication. Tumor-specific features of the carcinoma cells promise targeted therapies an increase in the response while reducing the side effects. A starting point is the epidermal growth factor receptor (EGFR). Activating mutations of EGF-dependent signal cascades represent a central problem in the therapy of metastatic colorectal carcinoma. Tumor markers that predict a therapy response are therefore of great importance in the context of therapeutic planning. Tumor markers can be indicative for a tumor because they are either exclusively present in a tumor disease or are expressed more intensively compared to a healthy person. Another critical point is the identification of possible mechanisms that can help to break the resistance against targeted therapies. The tumor suppressor gene (TUSC3/N33) may be a potential candidate for achieving this goal. TUSC3 is a subunit of the oligosaccharyltransferase (OST) complex at the membrane of the endoplasmatic reticulum (ER). N-glycosylation of GFRs like EGFR guarantees a correct insertion of transmembrane proteins into the ER-membrane, also the bulk ER-to-Golgi transport and stable emplacement at the plasma membrane. As TUSC3 is involved in N-glycosylation and EGFR requires N-glycosylation for its normal function, the hypothesis has been formulated that TUSC3 promotes cell death by either reducing the protein level or the activity of EGFR in CRC cells. The epidermal growth factor receptor family (EGFR) is the first link in a complex signaling cascade. This is essential, among other things, for cell proliferation, survival, adhesion, migration and differentiation. The EGFR family can also be transported from the plasma membrane into the nucleus. A strong increase in nuclear EGFR (n-EGFR) was detected in the tumor tissue. This increase in n-EGFR correlates with a poor clinical outcome for various tumor entities. However, the molecular function of TUSC3 in CRC remained unknown. The main objective of this study was the epigenetic and functional analysis of TUSC3 in colorectal cancer. Specific aims were the study of epigenetic regulation by analyzing the methylation level of the TUSC3 promotor. It was therefore necessary to validate the methylation of the TUSC3 promoter at the beginning of the study by determining the degree of methylation of the tissue samples of the individual patients. Furthermore, the influence of the methylation degree on the expression of the endogenous TUSC3 protein in the tissue samples was investigated. In addition, the influence of TUSC3 on "downstream signaling", the phosphorylation, and the advent of EGFR in the different cell VIII compartments was investigated. A subcellular fractionation was performed for the specific EGFR study in the nucleus. Furthermore, the influence on the signal propagation at a later point of the signaling pathway should be analyzed. In addition, the possibility of a link between TUSC3 and N-glycosylation by means of tunicamycin was investigated. The localization of TUSC3 was also monitored by immunofluorescence labeling with the help of specific antibodies. Because we previously demonstrated that TUSC3 inhibited EGFR signaling, we focused on the specific carcinoma characteristics. These include changes in proliferation and apoptosis. Both are regulated by EGFR signaling. Last but not least, the clinical relevance of TUSC3 was examined. In particular, in relation to the therapy resistance to cetuximab, the question arose as if TUSC3 could possibly be used as a tumor marker. In the present work, it was demonstrated that TUSC3 is located at the ER of the colorectal carcinoma. Thus, it was also confirmed that TUSC3 is regulated in colorectal carcinoma, by hypermethylation, by reducing the expression of mRNA and, thus, the protein expression of TUSC3. As an exemplary target protein of TUSC3, the EGFR was identified for the first time in this thesis. This correlation has not yet been demonstrated in any other tumor entity. The thesis has shown that TUSC3 inhibits the activity of phosphorylated EGFR and prevents the accumulation of nuclear EGFR. In addition, it was found that TUSC3 also reduces expression of p-AKT and p-ERK1/2, which promote proliferation in the carcinoma cell, downstream of the RAS/RAF/MEK/ERK and PI3K/PTEN/AKT/mTOR pathway and prevent apoptosis. An additional validation was based on the microarray, which also showed an influence of TUSC3 on genes of N-glycosylation and apoptosis. TUSC3 showed no influence on the EGFR degradation and the presence on the plasma membrane as to the transferrin receptor control. Thus, TUSC3 seems to have an apoptotic function in ER which inhibits tumor growth and thus protects a protective function in colorectal carcinoma. The study of the reporter plasmids revealed that TUSC3 inhibits various tumor-relevant signaling pathways, above all the WNT pathway. TUSC3 could contribute to the early detection and prognosis of human KRK as a potential new biomarker and would be an important starting point for the early analysis of chemoresistance in the systemic treatment of KRK.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Boutros, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 7 May 2018
Date Deposited: 28 May 2018 06:18
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: TUSC3, Kolorektales Karzinom, Darmkrebs, Epigenetik
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