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Reconstitution of clathrin coated vesicles

Brod, Jan

German Title: Rekonstitution Clathrin beschichteter Vesikel

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Abstract

Receptor-mediated endocytosis by clathrin coated vesicles (CCVs) is a well investigated process, in which clathrin, the adaptor AP-2 and the large GTPase dynamin play crucial roles. However, the minimal machinery for the formation of CCVs has not been defined in vitro. Specifically, scission of clathrin coated endocytic buds (CCBs), the last step in this process that results in the release of free vesicles, is not clearly defined mechanistically. Actually, five APcomplexes are described and except AP-2, all are recruited in an Arf-dependent manner to their donor membrane. Here, Arf is likely to play a distinct and GTPase activity-independent role in the scission mechanism via its myristoylated amphipathic helix, as has been shown for Arf’s role in COPI vesicle scission. In case of AP-2 no Arf is known to be involved, but it has been shown that epsin-1 with its N-terminal amphiphilic helix (ENTH-domain) is an endocytic accessory protein involved in the biogenesis of endocytic clathrin coated vesicles and was suggested to be implicated in scission. To identify the minimal machinery required for CCV formation and to investigate the molecular roles of dynamin and epsin-1 in this process, an in vitro reconstitution system for the biogenesis of CCVs was established using defined components in the form of synthetic membranes and recombinant, purified proteins. I observed that a combination of AP-2 and epsin-1 recruits clathrin to synthetic liposomes more efficiently than each single adaptor, indicating cooperativity between AP-2 and epsin-1. CCVreconstitution experiments with giant unilamellar vesicles showed that clathrin coated vesicles can be reconstituted dependent on clathrin adaptors, clathrin, dynamin and GTP. Moreover, blocking GTP-hydrolysis abolished the formation of CCVs, supporting the widely accepted hypothesis that hydrolysis of GTP by dynamin is mandatory for vesicle release. However, as hydrolysis of GTP was an absolute requirement of vesicle release, epsin-1 alone does not have the propensity for scission, but is required for bud formation, as AP-2 and clathrin alone are not sufficient. A role of the endocytic protein epsin-1 for the progression of endocytosis to CCBs would also be structurally supported as epsin-1 contains a membrane bending ENTH-domain that would facilitate such a function by introducing curvature to the membrane. In summary this work comprises the first in vitro reconstitution system of endocytic CCVs that uses full length proteins in a chemically defined environment. Using this system, I confirmed and refined the roles of known constituents of the minimal endocytic CCV biogenesis machinery, which is comprised of AP-2, epsin-1, clathrin, dynamin, and by GTP-hydrolysis in dynamin.

Translation of abstract (German)

Die Rezeptor-vermittelte Endozytose durch Clathrin Vesikel (CCV) ist ein umfassend untersuchter Prozess, bei dem Clathrin, der Adapterkomplex 2 (AP-2) und die große GTPase Dynamin zentrale Rollen spielen. Die minimale Maschinerie zur Bildung endozytotischer Clathrin Vesikel wurde in vitro jedoch noch nicht definiert, wobei insbesondere die Abschnürung endozytotischer Clathrin Knospen (CCB) zu freien Vesikeln mechanistisch nicht eindeutig geklärt ist. In der Literatur werden fünf AP-Komplexe beschrieben, die mit Ausnahme von AP-2 durch direkte Interaktion mit kleinen GTPasen der Arf-Familie an die Membran rekrutiert werden. Hierbei könnten Proteine der Arf-Familie, vermittelt durch ihre myristoylierte amphipathische Helix, eine wichtige Funktion in der Abspaltung zu freien CCV haben, ähnlich wie es für die Abschnürung von COPI-Vesikeln durch Arf gezeigt wurde. Bei der Biogenese von endozytotischen Clathrin Vesikeln ist eine direkte Beteiligung von Proteinen der Arf-Familie nicht bekannt. Allerdings könnte hierbei das Protein Epsin, welches ebenfalls eine amphiphile Helix am Ende der sogenannten ENTH-Domäne besitzt, alternativ zu Arf an der Abschnürung von CCVs beteiligt sein. Um die Frage nach den notwendigen Komponenten zur Bildung endozytotischer CCV und eines generellen Abspaltungsmechanismus zu beantworten wurde in dieser Arbeit ein in vitro Rekonstitutionssystem mit chemisch definierten Komponenten etabliert. Experimente zur Charakterisierung der rekombinant exprimierten Proteine zeigten einen kooperativen Effekt zwischen AP-2 und Epsin-1, sowohl in der Rekrutierung von Clathrin an synthetische Liposomen, als auch in der Menge an membrangebundenem Adaptor. Experimente zur Rekonstitution von CCV mit großen unilamellaren Vesikeln (GUVs) als Donor-Membranen zeigten eine deutliche Abhängigkeit der Vesikelbildung von Clathrin, einem Clathrinadaptor, Dynamin und GTP. Darüber hinaus war die Hydrolyse von GTP durch Dynamin für die Vesikelfreisetzung zwingend erforderlich. Eine Freisetzung von CCV konnte jedoch nur in Anwesenheit von Epsin beobachtet werden, das allerdings nicht die Abspaltung von CCVs direkt bewirken kann. Elektronenmikroskopische Aufnahmen negativ kontrastierter Proben haben gezeigt, dass AP-2 allein nicht in der Lage ist CCBs zu bilden. Dies legt nahe, dass das endozytotische Protein Epsin mit seiner Membrankurvatur induzierenden ENTHDomäne einen wichtigen Faktor in frühen Stadien der Biogenese von CCVs ist sowie für deren Reifung darstellt. Unter Verwendung des hier etablierten Rekonstitutionssystems haben ich die Rolle bekannter Komponenten der minimalen Maschinerie bestätigt und ergänzt, welche aus AP-2, Epsin-1, Clathrin, Dynamin und der Hydrolyse von GTP durch Dynamin besteht.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Felix
Date of thesis defense: 24 July 2018
Date Deposited: 07 Aug 2018 12:01
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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