German Title: Reprogrammierung von M2 Makrophagen durch CD4+ T-Zellen, Transkriptionsfaktor Herunterregulation und Transfektion von miRNAs

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Abstract

Macrophages are a subset of myeloid cells showing phenotypic and functional plasticity. Tumor cells secrete chemokines which attract macrophages resulting in their accumulation within the tumor microenvironment. Depending on the environmental signals they receive, these tumor associated macrophages (TAMs) can differentiate into M1-like or M2-like TAMs with different phenotype and function. M1-like TAMs produce proinflammatory cytokines and display tumoricidal activity, whereas M2-like TAMs have an immunosuppressive phenotype typically associated with enhanced tumor growth. At later stages of tumor development, the majority of TAMs resemble the M2-like phenotype, thereby contributing to the establishment of an immunosuppressive tumor microenvironment. As M2-like TAMs are generally associated with poor prognosis in most tumor entities, they are considered as a suitable target for cancer therapy. In this study, we reprogrammed M2-like macrophages by cognate interaction with CD4+ T cells, transcription factor knockdown and miRNA transfection. Within the first part of the thesis, we demonstrate by comprehensive gene and protein expression analyses as well as functional assays that M2-like (IL-4 treated) peritoneal exudate cells (PECs) can be repolarized in vitro into immunostimulatory M1-like macrophages through cognate interaction with CD4+ T cells. Moreover, a MHC II (IAb) deficient, ovalbumin (OVA) expressing B16F10 clone (M2KO/OVA) was established to investigate the effect of adoptively transferred OVA specific CD4+ T cells on TAM polarization in a mouse model where MHC II restricted interaction between tumor cells and T cells is precluded. Adoptive transfer of CD4+ T cells into M2KO/OVA tumor bearing mice resulted in a decreased expression of the M2-associated protein CD206 and an increased expression of M1-associated genes (Il1b, Cd86, Cxcl10 and Nos2) in TAMs freshly isolated from M2KO/OVA tumors, pointing towards reprogramming of M2-like TAMs. In the second part of the project we combined transcription factor (TF) binding information with RNA expression profiles of in vitro polarized PECs and identified five transcription factors (CTCF, E2F1, MYC, PPARү and STAT6) involved in the induction and maintenance of the M2-like phenotype. siRNA mediated knockdown of these TFs in M2 polarized PECs induced the expression of M1-associated genes, whereas the expression of M2-associated genes was significantly reduced. In addition, the expression of proinflammatory cytokines (IL-1α, IL-6, MCP-1 and TNFα) was upregulated upon siRNA mediated TF knockdown, demonstrating a successful reprogramming of M2-like macrophages. In the third part of the project we were aiming at the identification of miRNAs involved in macrophage polarization. Therefore, we performed small RNA sequencing of in vitro polarized PECs, leading to the identification of 19 miRNAs which were differentially expressed between M1-like and M2-like macrophages. Based on their expression level and their expression fold changes, six miRNAs significantly upregulated in M1-like PECs were selected for subsequent validation. The expression analysis of M2-like and untreated PECs upon co-transfection of these miRNAs revealed enhanced expression levels of M1-associated genes and decreased expression levels of M2-associated genes, indicating a polarization towards the M1-like phenotype. Taken together, our results reveal new insights into the transcriptional, post-transcriptional and T cell mediated reprogramming of macrophages and might be useful for the identification of novel therapeutic targets to repolarize M2-like TAMs.

Translation of abstract (German)

Makrophagen sind myeloide Zellen, die eine große phänotypische und funktionale Plastizität aufweisen. Tumorzellen sekretieren Chemokine, die eine Akkumulation von Makrophagen im Tumormikromilieu induzieren können. In Abhängigkeit von den umgebenden Signalen können diese Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) in M1 oder M2 Makrophagen mit unterschiedlichem Phänotyp differenzieren. M1 TAMs produzieren proinflammatorische Zytokine und haben eine tumorizide Aktivität, während M2 TAMs einen immunsupprimierenden Phänotyp aufweisen und mit verstärktem Tumorwachstum assoziiert sind. In späteren Tumorstadien weisen die meisten infiltrierten Makrophagen einen M2 Phänotyp auf und tragen dadurch zu der Etablierung eines immunsupprimierenden Tumormikromilieus bei. M2 polarisierte Makrophagen sind in den meisten Tumorentitäten mit einer schlechten Prognose assoziiert und stellen daher ein geeignetes Ziel für Krebstherapien dar. In dieser Arbeit konnten M2 Makrophagen durch die MHC II restringierte Interaktion mit CD4+ T-Zellen, die Herabregulation von Transkriptionsfaktoren (TFs) oder durch die Transfektion von miRNAs zu M1 Makrophagen reprogrammiert werden. Im ersten Teil der Arbeit wird anhand umfassender Genexpressionsanalysen und mithilfe funktionaler Testverfahren gezeigt, dass M2 polarisierte (IL-4 induziert) peritoneale Exsudatzellen (PECs) durch eine antigen-spezifische Interaktion mit CD4+ T-Zellen in vitro in M1 Makrophagen repolarisiert werden können. Außerdem wurde ein IAb defizienter, Ovalbumin (OVA) exprimierender B16F10 Klon etabliert (M2KO/OVA), um die Effekte von adoptiv transferierten CD4+ T-Zellen auf TAMs unter Ausschluss einer direkten MHC II restringierten Interaktion zwischen Tumorzellen und T-Zellen in vivo untersuchen zu können. Der adoptive Transfer von CD4+ T-Zellen in M2KO/OVA tumortragende Mäuse resultierte in einer verminderten Expression des M2-assoziierten Proteins CD206 und einer erhöhten Expression von M1-assoziierten Genen (Il1b, Cd86, Cxcl10 and Nos2) in frisch isolierten TAMs aus M2KO/OVA Tumoren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden, auf Grundlage vorhergesagter TF Bindungsstellen und experimentell ermittelten RNA Expressionsprofilen von in vitro polarisierten PECs, fünf TFs identifiziert (CTCF, E2F1, MYC, PPARү and STAT6), die für die Induktion und Aufrechterhaltung eines M2 Phänotyps von Bedeutung sind. Eine siRNA vermittelte Herunterregulation dieser TFs induzierte die Expression von M1-assoziierten Genen, wohingegen die Expression von M2-assoziierten Genen signifikant reduziert war. Zusätzlich war die Expression von proinflammatorischen Zytokinen (IL-1α, IL-6 and TNFα) nach siRNA Transfektion erhöht, wodurch die erfolgreiche Repolarisierung der M2 Makrophagen zusätzlich bestätigt werden konnte. Im dritten Teil des Projektes wurden basierend auf miRNA Sequenzierdaten von in vitro polarisierten PECs 19 miRNAs detektiert, die zwischen M1 und M2 polarisierten Makrophagen differentiell exprimiert waren. Basierend auf deren Expressionsstärke wurden sechs miRNAs mit hoher Expression in M1 Makrophagen für die weitere Validierung ausgewählt. Nach Ko-Transfektion aller sechs miRNAs in M2 PECs oder in unbehandelte PECs wurde eine erhöhte Expression von M1-assoziierten Genen und ein reduziertes Expressionsniveau von M2-assoziierten Genen detektiert, was auf eine Polarisation in Richtung des M1 Phänotyps hindeutet. Unsere Ergebnisse gewähren neue Einblicke in die transkriptionelle, post-transkriptionelle und durch T-Zellen vermittelte Umprogrammierung von Makrophagen und könnten für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Repolarisation von M2 TAMs nützlich sein.