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In cellulo architecture of the nuclear pore complex

Zimmerli, Christian Eugen

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Abstract

Nuclear pore complexes (NPCs) reside at the nuclear envelope (NE) where they mediate nucleocytoplasmic exchange. They are large macromolecular assemblies built by several hundred protein building blocks, so-called nucleoporins (Nups), which form numerous subcomplexes to fuse the inner and outer nuclear membranes and form massive 8-fold rotational symmetric nuclear pore. Solving the structure of NPCs as a whole imposes a tremendous challenge. Yet, integrated structural analysis approaches led to the determination of the human, S. cerevisiae (sc) and the green algae C. reinhardtii NPC scaffold architecture, in situ, in vitro and in cellulo, respectively. It is apparent that NPCs across species, although varying in their subcomplex composition and stoichiometry, follow a common architectural building concept. Three distinct rings stacked across the NE form the NPC scaffold. The inner ring forms a central channel, and together with the flanking, cytoplasmic and nuclear rings, ensures the nuclear pore stability. The outer rings are built by a head-to-tail arrangement of the so-called Y-complex. In humans, two concentric rings form each of the two outer rings while in S. cerevsiaie only one Y-complex ring on each side of the NPC is found. In algae, two Y-rings form the nuclear ring while only one ring is present on the cytoplasmic side. The metazoan-specific Nup358 mediates the cytoplasmic Y-complex dimerization in human, however, the corresponding factor mediating the nuclear ring dimerization remains elusive in all species to date. It is suspected that NPCs might adapt their central channel diameter in response to a large variety of cues to alter nuclear transport. However, what exactly causes such a conformational change within actively transporting cells and how it is mediated on a molecular level is not known. Here, I solved the structure of the S. pombe (sp) NPC within intact cells. I show how a split Y-complex interface on the cytoplasmic face of the spNPC breaks the outer ring conformation and thus challenges the long-standing dogma of a three-ringed NPC architecture. I found two concentric Y-rings on the nuclear side of the spNPC. A candidate protein to mediate this interface was the nucleoporin Ely5, which is only found in species showing two concentric nuclear rings. However, upon analyzing the NPC architecture of an ely5Δ knockout strain, I could rule out Ely5 as a sufficient Y-complex dimerization factor. In collaboration with Matteo Allegretti, we solved an in cellulo scNPC structure and show how it differs from the previously proposed in vitro derived architecture. We re-orient the previously proposed mRNA export platform model anchored at the cytoplasmic ring 9 to be more in line with the spatiotemporal events coordinating mRNP nuclear export. I further present an in-depth comparison between the two yeast to the human and algal NPC architectures revealing that while the inner ring remains highly conserved, the architecture of the outer rings, the mRNA export platform, as well as the connections between subcomplexes varies more than previously anticipated. To understand how NPCs adopt their conformation during active nuclear transport on a molecular level, I solved a spNPC structure under energy depletion conditions where active nuclear transport is thought to be completely halted. This analysis exhibits a constricted NPC conformation, revealing how the NPC scaffold undergoes a conformational change on a molecular level in response to a well-defined cue. Finally, I investigate how the transmembrane nucleoporin Pom152 (hsGP210), a protein known to form a ring surrounding the NPC within the NE lumen, might be involved in NPC diameter control. By analyzing a human gp210Δ cell line I could show that while GP210 is dispensable for proper NPC biogenesis, the missing luminal ring did not influence the human NPC diameter observed under the conditions described here.

Translation of abstract (German)

Kernporenkomplexe (NPCs) befindend sich in der Zellkernhülle, wo sie den Transport von Molekülen in und aus dem Zellkern ermöglichen. NPCs sind große makromolekulare Komplexe, welche aus hunderten von Proteinen, so genannten Nukleoporinen (Nups) aufgebaut sind. Diese bilden zahlreiche Subkomplexe, welche die innere und äußere Zellkernmembran verschmelzen und dabei eine acht-fach rotationssymmetrische Struktur bilden. Die Strukturaufklärung von NPCs ist eine außerordentliche Herausforderung. Trotzdem wurde die in situ Struktur des humanen (hs) NPC, die in vitro Struktur des S. cerevisiae (sc) NPC und die in cellulo Struktur des NPCs der Grünalge C. reinhardtii durch integrative strukturelle Ansätze aufgeklärt. Obwohl die Subkomplexorganisation und Stöchiometrie zwischen verschieden Spezies variiert, folgt die generelle NPC Architektur einem gemeinsamen strukturellen Konzept: Drei aufeinander gestapelt Ringe durchdringen die Zellkernhülle und bilden einen und zentralen Kanal aus. Die sogenannten inneren und äußeren Ringe Ring bilden das NPC Grundgerüst und verleihen der Kernpore Stabilität. Der sogenannte Y-Komplex bildet die äußeren Ringe der humanen Kernpore durch zwei konzentrische Y-Komplexringe, während in S. cerevisiae nur jeweils ein Y-Komplexring vorkommt. In Algen hingegen finden wir zwei Y-Komplexringe auf der nuklearen Seite, während der zytoplasmatische Ring nur durch einen Y-Komplexring gebildet wird. In Metazoa vermittelt das Nukleoporin Nup358 die Dimerisierung des zytoplasmatischen Y-Komplexes. Welche Faktoren hingegen diese Rolle auf der nuklearen Seite übernehmen ist bis heute gänzlich unbekannt. Seit längerem vermutet man, dass der Durchmesser seines zentralen Kanals von Kernporen unter bestimmten Umständen variiert. Was aber genau eine solche Anderung des zentralen Kanaldurchmessers in aktiv transportierenden und intakten Zellen verursacht und wie diese Anderungen auf einer molekularen Ebene vermittelt werden, bleibt eine offene Frage.

Hier habe ich die Struktur vom NPC in intakten Zellen der Spalthefe S. pombe aufgeklärt. Ich zeige wie in S. pombe die Separierung von zwei interagierenden Nukleoporinen im YKomplex auf der zytoplasmatischen Seite die Ringanorung bricht und dabei dem langjährigen Dogma einer NPC Architektur aus drei Ringen widerspricht. Auf der nuklearen Seite hingegen finde ich nach wie vor eine doppelte Anordnung des Y-Komplexes. Da das Nukleoporin Ely5 bis heute nur in Spezies gefunden wurde, in welchen wir eine konzentrische Anordnung des Y-Komplexes im nuklearen Rings beobachten, ist Ely5 ein interessanter 11 Kandidat, welcher diese Y-Komplex dimerisierung vermitteln könnte. Durch die Analyse einer ely5Δ Deletionsmutante konnte ich jedoch Ely5 als Y-Komplex-Dimerisierungsfaktor ausschließen. In Kollaboration mit Matteo Allegretti haben wir weiter die Struktur des scNPCs in cellulo aufgeklärt. Dabei konnten wir zeigen, dass sich die NPC Struktur in einer intakten Zelle sich vom bisher vorgeschlagenen Strukturmodell, welches auf der Analyse von isolierten NPCs basiert, unterscheidet. Zudem schlagen wir hier eine neue Orientierung der mRNA-Exportplatform vor, die besser mit der zeitlichen und räumlichen Abfolge der molekularen Prozesse währed des mRNA-Exports übereinstimmt. Weiter habe ich in dieser Arbeit die zwei hier präsentierten Hefe NPC Strukturen mit den bereits bekannten aus Strukturen dem Menschen und Algen verglichen. Dabei wird klar, dass die äußeren Ringe, die mRNA-Exportplatform sowie die Verbindungselemente zwischen den äußeren und dem inneren Ring deutlich mehr variieren als bisher angenommen, während der innere Ring selbst relativ konserviert bleibt. Um besser zu verstehen wie sich die NPC Konformation während des aktiven nukleozytoplasmatischen Transports verändert, habe ich die spNPC Struktur in ATP-verminderten Zellen analysiert, wobei aktiver nukleo-zytoplasmatischen Transport nicht stattfinden sollte. Unter diesen Bedingungen finden wir den spNPC in einem komplett verengtem Zustand vor. Daher konnte ich hier zum ersten Mal überhaupt zeigen, wie sich die Konformation des NPC Gerüsts auf der molekularen Ebene als Reaktion auf einen wohl definierten Stimulus ändert. Zum Schluss habe ich untersucht, ob und wie das Transmembran-Nukleoporin Pom152 (hsGP210), ein Protein von dem man weiß, dass es den NPC im Lumen der Kernhülle umringt, den Durchmesser vom NPC kontrolliert. Die Analyse einer humanen gp210Δ Deletionsmutatne offenbart, dass der fehelende luminale Ring den Durchmesser des NPC unter den hier beschriebenen Konditionen nicht beeinflusst.

Document type: Dissertation
Supervisor: Hurt, Prof. Dr. Ed
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 2 April 2020
Date Deposited: 26 May 2020 12:15
Date: 2020
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
DDC-classification: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: nuclear pore complex; Schizosaccharomyces pombe; nucleoporin; nup; cryo-EM; cryo-ET; electron tomography ;subtomogram averaging; cryo-FIB milling; NPC; dilation
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