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Abstract

Infektionen mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) und dem Hepatitis-D-Virus (HDV) stellen eines der größten Gesundheitsrisiken weltweit dar. Als Virusoid produziert HDV keine eigenen Hüllproteine, sondern ist auf HBV als Helfervirus angewiesen. Eine HBV/HDV-Ko-infektion gilt als schwerste Form der Hepatitis und bislang stehen nur stark limitierte Therapieoptionen zur Verfügung. Der first-in-class Eintrittsinhibitor Myrcludex B (Bulevirtide), ein synthetisches 47 Aminosäuren langes Lipo-peptid, das sich von der preS1 Domäne des großen HBV Oberflächenproteins L-HBsAg ableitet, stellt die erste zielgerichtete Therapie gegen eine HDV-Infektion dar. Es besetzt die Bindestelle der Virushülle am Eintrittsrezeptor sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP) und verhindert die Aufnahme des Viruspartikels in die Hepatozyte. Myrcludex B wurde in der Forschung vielseitig genutzt z.B. zur Identifizierung von NTCP als viraler Eintrittsrezeptor oder zum spezifischen Transport anderer Moleküle zur Leber. Vor allem die essentielle Sequenz, Aminosäuren 9-15, wurde intensiv untersucht. Da derzeit keine Kristallstruktur von NTCP bekannt ist, ist der exakte Bindemechanismus von Myrcludex B und der Viren schwer zu erfassen.

Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, Sequenzbereiche innerhalb der akzessorische Domäne (Aminosäuren 22-48) von Myrcludex B zu identifizieren, die entscheidend zur Wirksamkeit beitragen und diese zu charakterisieren. Es wurden verschiedene Peptide mittels Festphasen-peptid¬synthese hergestellt, die durch Deletionen, Alanin-Austausch und Austausch der akzessorischen Domäne gegen wirtsfremde Peptid¬bereiche verändert wurden. Dabei konnte das PDWD-Motiv (Positionen 30-33) identifiziert werden, welches auch in den wirtsfremden Sequenzen vorzufinden war. In Bindungs¬versuchen mit fluoreszenzmarkierten Peptiden und in vitro HBV/HDV-Infektionen konnte gezeigt werden, dass eine intakte akzessorische Domäne für die spezifische Zellbindung sowie die hochpotente Inhibition des Viruseintritts nötig ist. Die Deletion der akzessorischen Domäne resultierte in einem ca. 100-fachen Wirkverlust, ein Alanin-Austausch von 32Trp und 33Asp führte zu einem ca. 20-fach erhöhten IC50-Wert. Die spezifische Leberanreicherung hängt hingegen von der essentiellen Sequenz des Peptids ab, was mittels 125Iod-markierten Peptiden im Mausmodell festgestellt werden konnte. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass das PDWD-Motiv als Gallensäure-Imitationssequenz mit der Substratbindetasche von NTCP interagiert.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde die aufgestellte Hypothese untersucht, indem potentielle duale NTCP-Inhibi¬toren synthetisiert charakterisiert wurden. Dazu wurden Syn¬these¬strategien etabliert, um Arznei¬stoffe, die von NTCP transportiert werden, mit unterschiedlichen Peptiden zu konjugieren, welche keine akzessorische Domäne besitzen. In HBV/HDV-Infektionen in vitro waren deutliche Aktivitätsunterschiede der verschiedenen hybriden Moleküle zu beobachten; variierend einerseits nach Kopplungsposition, andererseits nach Kopplungspartner. Ebenso waren unter-schiedlich starke Einflüsse auf den physiologischen Gallensalztransport festzustellen. Die deutliche, synergistische Wirksteigerung der synthetisierten Substanzen stützt die aufgestellte Hypothese. Um die isolierte inhibitorische Effektivität der verwendeten Arzneistoffe in Infektionen unter-suchen zu können, wurde ein HDV-Infektionsmodell etabliert. Es war möglich, eine hochaktive Leitsubstanz „myr-2-21yK(TRIAC)“ zu synthetisieren und charakterisieren. Das Molekül zeigte keine Zytotoxizität, während im Vergleich zum Vorläufer¬peptid eine verbesserte Wirksamkeit in vitro und eine verlängerte leberspezifische Halbwertszeit in vivo erreicht wurde: myr-2-21yK(TRIAC) inhibierte HBV- bzw. HDV-Infektionen sechs¬fach bzw. 30-fach stärker und reicherte sich im Mausmodell spezifisch in der Leber und der Milz an. Die Leitsubstanz wird schneller von der Milz als von der Leber eliminiert und verbleibt mit einer Halbwertszeit von acht Stunden im Vergleich zum Edukt-Peptid doppelt so lang am Wirkort.