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Abstract

The RAS proteins belong to the superfamily of monomeric GTPases mediating the transmission of extracellular signals from cell-surface receptors to other parts of the cell. Upon activation, RAS induces a wide range of downstream signaling pathways that control fundamental cellular processes, such as proliferation, growth, motility and stress response. Activating point mutations in RAS are known drivers of cancer development in epithelial cells. The p53 tumor suppressor is activated in response to excessive RAS activity, driving the cell into senescence or apoptosis. This is believed to serve as a potent mechanism for cancer suppression. Therefore, successful RAS-driven oncogenic transformation needs to override the tumor suppressive effects of p53. Indeed, RAS-driven cancers are often a ssociated with an impairment of p53 functionality, most typically by mutation of the TP53 gene. However, some RAS-driven tumors nevertheless retain wild type p53. The interplay of p53 and oncogenic RAS mutations in such tumors, during their transformation and progression, remains understudied. In this work, I aimed to characterise alterations driven by the expression of the mutant (G12V) HRAS in non-malignant human mammary epithelial MCF10A cells on the proteomic, transcriptomic, and phenotypic levels. Furthermore, I investigated the influence of wild-type p53 on the outcome of the aberrant RAS signaling. First of all, I implemented the nascent proteome analysis to accurately quantify the alterations in protein expression upon constitutive RAS signalling. This analysis indicated activation of RAS downstream effectors, a metabolic shift towards glycolysis, as well as upregulation of YAP-activation signatures and EMT markers upon mutant HRAS expression. These observations were further confirmed by transcriptome analysis. Importantly, some of the effects of the mutant HRAS were shown to be dependent on p53. Particularly, the expression of EMT markers and signatures of YAP activation was reduced upon p53 silencing exclusively in the mutant HRAS expressing MCF10A cells. In contrast, p53 knockdown in non-transformed MCF10A cells caused only minor and dissimilar effects on gene and protein expression. Subsequent phenotypic characterisation supported the conclusion that migration and invasion properties of the cells depend on both mutant RAS and p53 expression. Therefore, my results indicate that p53 functions are altered in RAS-transformed cells, causing the wild-type p53 to act in an oncogene-cooperative manner in that cellular context. Along this line, I applied ChIP-SICAP, a method for the selective isolation of chromatin-associated proteins, to identify the on-chromatin interactors of p53 in MCF10A cells. To study mutant RAS-driven alterations in the p53 interactome and elucidate the mechanisms of oncogene-dependent p53 activity, ChIP-SICAP was applied to WT and HRAS mutant MCF10A cells. While the comparison on their interactomes revealed high conformity, a few proteins were found to be differentially represented depending on mutant HRAS expression. Therefore, these pivotal p53 interactors might play a mechanistic role in mediating the oncogenic signaling-dependent alterations in the activity of p53. Finally, I analysed mutant HRAS-driven alterations in the composition of secreted proteins. This analysis revealed upregulation of the secretion of growth factor receptor ligands. Therefore, the outcome of constitutive HRAS activity might be partially determined by autocrine stimulation. The analysis also confirmed the up-regulation of EMT markers in the extracellular space and revealed the down-regulation of ECM remodelling proteins. Overall, I elucidated alterations in the activity of signalling pathways and transcription factors driven by mutant HRAS, and showed that in successfully transformed cells wild-type p53 cooperates with the oncogene to promote the effects of constitutive HRAS signaling in the epithelial cells. These results were confirmed by independent methods of proteomic, transcriptomic, and phenotypic analysis. The presented data can serve as a source of quantitative information for subsequent studies of individual mediators of mutant RAS-driven tumorigenesis.

Translation of abstract (German)

Die RAS Proteine gehören einer Superfamilie monomerer GTPasen an, die die Weiterleitung extrazellulärer Signale von Oberflächenrezeptoren zu anderen Kompartimenten der Zelle weiterleiten. Aktiviertes RAS induziert verschiedene nachgeschaltete Signalwege, die fundamentale zelluläre Prozesse wie Proliferation, Wachstum, Migration und Stressantwort kontrollieren. Aktivierende Punktmutationen in RAS Proteinen sind bekannte Auslöser von Karzinogenese in epithelialen Zellen. Die tumorigenen Effekte von mutierten RAS Proteinen sind häufig mit einem Verlust der Funktion von p53 assoziiert. Allerdings wurde das Zusammenspiel zwischen p53 und onkogenen RAS Mutationen im Verlauf der Transformation und Tumorprogression bisher nur unzureichend untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich das Ziel verfolgt, die proteomischen, transkriptomischen und phänotypischen Veränderungen zu charakterisieren, die durch die Expression von mutiertem (G12V) HRAS in gutartigen menschlichen Brustdrüsenzellen (MCF10A) hervorgerufen werden. Zudem habe ich den Einfluss von wildtyp p53 auf die Effekte von konstitutiver RAS Aktivität untersucht. Hierzu habe ich zunächst eine Analyse etabliert, die neu synthetisierte Proteine detektiert, um die Veränderungen in der Proteinexpression durch konstitutive Aktivierung von HRAS akkurat zu quantifizieren. Diese Analyse deutete auf die Aktivierung von nachgeschalteten RAS Effektoren eine metabolische Verschiebung hin zu vermehrter Glykolyse sowie eine erhöhte Expression von Proteinen der YAP-Aktivierungssignaturen und EMT Markern als Reaktion auf die Expression von mutiertem HRAS hin. Diese Beobachtungen wurden auf Transkriptomebene bestätigt. Bemerkenswerter Weise konnte ich zeigen, dass einige Effekte des mutierten HRAS Proteins abhängig von p53 waren. Im Speziellen waren die Expression von EMT Markern und Signaturgenen von YAP-Aktivierung im Zellen mit reduzierten p53 Leveln ausschließlich im Kontext von mutiertem HRAS reduziert. Im Gegensatz dazu rief der Knockdown von p53 in wildtyp Zellen geringere und unterschiedliche Effekte auf Gen- und Proteinexpression hervor. Die anschließende phänotypische Charakterisierung bestätigte, dass Migrations- und Invasionsfähigkeit der Zellen sowohl auf mutiertem HRAS als auch auf p53 Expression beruhen. Meine Ergebnisse legen also nahe, dass die Funktion von p53 durch konstitutives RAS verändert wird und dass wildtyp p53 dadurch in diesem Zellsystem kooperativ mit dem aktivierten Onkogen wirken kann. Um dies weiter zu bestätigen, habe ich ChIP-SICAP angewandt, eine Methode zur selektiven Isolation von Chromatin-assoziierten Proteinen, um die Interaktionspartner von p53 am Chromatin in MCF10A Zellen zu identifizieren. Um die Veränderungen im p53 Interaktom durch konstitutives RAS zu untersuchen und die Mechanismen der Onkogen-abhängigen p53 Aktivität zu beleuchten, wurde ChiP-SICAP für wildtyp und HRAS-mutierte MCF10A Zellen angewandt. Obwohl die beiden Interaktome sich sehr ähnlich waren, wurden einige Proteine zwischen beiden Konditionen unterschiedlich stark repräsentiert detektiert. Dementsprechend könnten diese p53 interagierenden Proteine eine mechanistische Rolle in der Vermittlung der Onkogen-abhängigen Veränderungen in der Aktivität von p53 spielen. Zuletzt habe ich die durch mutiertes HRAS hervorgerufenen Veränderungen in der Zusammensetzung von sezernierten Proteinen untersucht. Diese Analyse zeigte eine vermehrte Sezernierung von Liganden für Wachstumsfaktor-Rezeptoren. Dementsprechend könnten die Effekte von konstitutiver HRAS Aktivität möglicherweise zum Teil durch autokrine Stimulation erklärt werden. Diese Analyse bestätigte zudem die erhöhte Präsenz von EMT Markern im extrazellulären Raum und eine Reduktion von ECM remodellierenden Proteinen. Zusammenfassend habe ich die Veränderungen, die durch mutiertes HRAS hervorgerufen werden, auf der Ebene von Signalwegen und Transkriptionsfaktoren beschrieben und konnte dabei zeigen, dass wildtyp p53 mit dem Onkogen kooperiert, um die Effekte von konstitutiv aktiviertem HRAS in epithelialen Zellen zu verstärken. Diese Ergebnisse wurden durch unabhängige Methoden auf proteomischer, transkriptomischer und phänotypischer Ebene bestätigt. Die hier präsentierten Daten können zudem als Quelle für quantitative Informationen für Folgestudien an individuellen Mediatoren der durch mutiertes RAS vorangetriebenen Tumorigenese verwendet werden.