English Title: Molecular characterization of extracellular vesicles and analysis of their influence as regulators in immune responses

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PDF, German Download (4MB) | Lizenz: Charakterisierung extrazellulärer Vesikel und Analyse ihrer Bedeutung als Regulatoren der Immunantwort by Tucher, Christine underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EV) werden von nahezu allen Säugerzellen freigesetzt. Dabei sind verschiedene EV-Populationen in der Literatur bereits beschrieben worden. Mikrovesikel stehen für große Vesikel (GEV), die von der Plasmamembran freigesetzt werden, wohingegen Exosomen kleine Vesikel (KEV) sind, die von einem intrazellulärenKompartiment freigesetzt werden. In der Pathogenese des Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) liegt eine dysregulierte Apoptose vor, die sich in einer erhöhten Apoptoserate kombiniert mit einer verringerten Clearence darstellt. Dabei akkumulieren apoptotische Zellreste und Autoantigene, wobei noch ungeklärt ist, weswegen die Autoimmunität ausbricht. Ein Kennzeichen der Apoptose ist die Freisetzung von Vesikeln, wobei Zell-Aktivierung ebenso zur Freisetzung von Vesikeln führt. Diese gegensätzlichen Freisetzungsstimuli lassen vermuten, dass verschiedene Stimuli die Freisetzung diverser EV-Populationen verursachen. Diese Arbeit widmete sich der Charakterisierung von EV, die von T-Zellen freigesetzt wurden, unter Einbeziehung des Freisetzungsstimulus (Zell-Aktivierung vs. Apoptose-Induktion). Außerdem wurde untersucht welchen Einfluss EV auf dendritische Zellen (DZ) ausüben sowie der Frage, ob und welche Rolle EV in der Pathogenese des SLE einnehmen. Die Analyse zeigt, dass EV, isoliert von humanen T-Lymphozyten, zwei voneinander trennbare EV-Populationen (KEV <= 200 nm; GEV 200 bis 1000 nm) aufweisen. Apoptose-Induktion führte zu einer massiven Freisetzung von GEV, die Zell-Aktivierung hingegen zu deutlich geringeren Mengen an GEV und KEV. Auch die Proteinexpressionsmuster von GEV und KEV unterschieden sich je nach Freisetzungsstimulus. Die Stimulation von naiven DZ mit GEV und KEV, isoliert von aktivierten bzw. apoptotischen T-Zellen, führte zu einer Ausreifung der DZ (Hochregulierung: CD83, CD80, CD86, CD274), jedoch zu einer Herabregulation von MHC- Klasse II (am deutlichsten durch Stimulation mit GEV). Das sezernierte Zytokinmuster spiegelte kein eindeutiges Inflammations-/Suppressionsprofil wieder. EV, isoliert aus kultivierten T-Zellen von SLE-Patienten, zeigten deutliche Unterschiede verglichen mit denen von Normalspendern und weiteren Kontrollen, in der Freisetzungsmenge als auch im Proteinprofil. Dabei spielte auch die Krankheitsaktivität (SLEDAI >= 6) eine Rolle. Zusammengefasst konnte in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt werden, (1) dass sich zwei EV-Populationen (GEV, KEV) in Größe und Proteinexpressionsmuster unterscheiden, (2) dass die differentielle Proteinexpressionen in EV abhängig vom Freisetzungsstimulus sind, (3) dass freigesetzte EV die DZ-Reifung und das von den DZ sezernierte Zytokinprofil beeinflussen können (deutliche Inhibition der MHC- Klasse II-Expression), (4) dass beim Vergleich der Proben von SLE-Patienten vs. gesunder Individuen eine deutlich reduzierte Freisetzung von GEV und KEV bei SLE-Patienten auftritt. Außerdem zeigen Proteinanalysen von SLE-Patienten verglichen mit denen gesunder Individuen Unterschiede in der Proteinbeladung der verschiedenen EV-Subpopulationen.

Translation of abstract (English)

Extracellular vesicles (EVs) are released from nearly all mammalian cells. Therefore, different EV populations have been described in the literature. Microvesicles represent large EVs (LEVs) released from the cellular surface, while exosomes are small EVs (SEVs) released from an intracellular compartment. The pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE) is characterized by a dysregulation of apoptosis. Hallmarks are an increased apoptosis combined with a diminished clearence. Thus, an accumulation of apoptotic cell remnants and autoantigens occurs, yet, it is still unclear how autoimmunity arises. A hallmark of apoptosis is the release of EVs, but also cell activation leads to EV release. These contrary release factors are promoting the hypothesis that different stimuli are responsible for the release of diverse EV subpopulations. This work investigated the systemic characterization of EVs from T-cells considering the different release stimuli (activation vs. apoptosis induction). Moreover, it was analysed which influence EV exert on dendritic cells (DCs) and including their role in the pathogenesis of SLE. The analysis confirmed that isolated EVs from human T-cells could be seperated into two EV populations (SEVs <= 200 nm; LEVs 200 until 1000 nm). Apoptosis induction caused a massive release of LEVs, while activation leads to considerably lower amounts of released SEVs and LEVs. Protein expression patterns of LEVs and SEVs were different depending on the release stimulus. Stimulation of naive DCs with LEVs and SEVs, isolated from activated or apoptotic T-cells lead to a maturation of DCs (upregulation: CD83, CD80, CD86, CD274), but to a downregulation of MHC- class II (strongest through stimulation with LEVs). The secreted cytokin pattern displayed no clearly inflammatory or anti inflammatory profile. EVs, isolated from cultivated T-cells of SLE patients, showed differences in the amount of released vesicles as well as in the protein profile compared with those from normal healthy donors and further controls. Additionally, the disease level (SLEDAI >= 6) played a role as well. Taken together it was observed, (1) that two EV subpopulations could be detected (LEVs, SEVs), which are differing in sizes and protein expression patterns, (2) that differential protein expressions in EV are related to the release stimulus, (3) that released EVs influence DC-maturation and cytokine secretion (strongly inhibited expression of MHC- class II), (4) that comparing samples from SLE patients vs. healthy individuals, a far lower release of LEVs and SEVs occur in SLE patients. Moreover, protein analyses from SLE patients compared to healthy individuals show differences in the protein cargo of distinct EV subpopulations.