German Title: Erforschung von Proteinwechselwirkungen mittels 23Na Tripelquanten MRS und 1H Chemical Exchange Saturation Transfer MRI

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Abstract

Nuclear magnetic resonance (NMR) allows the non-invasive investigation of proteins using 23Na triple-quantum (TQ) and 1H chemical exchange saturation transfer (CEST) signals. Interactions of sodium ions with macromolecules yield an intracellular sensitive TQ signal. A TQ signal increase has been shown to correlate with the loss of cell viability. However, a deeper understanding of the TQ signal on a cellular level is necessary to determine its capability to serve as a potential biomarker for cell viability. CEST indirectly detects low concentrated organic compounds by their magnetization transfer with water. Protein-based CEST signals have been demonstrated in vitro to be closely connected to the protein folding state and have great potential as a non-invasive diagnostic tool for diseases, like cancer and neurodegenerative diseases. Nonetheless, the detectability of denaturation processes in living cells by CEST NMR remains to be verified experimentally. In the first part of this thesis, a dependence of the TQ signal on the pH and protein folding state was demonstrated using protein solutions. An increase in the availability of negatively charged groups in proteins caused an increase in the TQ signal during pH variation (224.5 +- 25.1%) or protein unfolding (40.7 +- 2.3%). Second, the cellular response to a Na/K-ATPase inhibition was monitored using improved TQ signal detection. The TQ signal increased by 38.9 +- 4.1% and 83.4 +- 8.9% during perfusion with 1 mM ouabain and 0 mM K+ medium, respectively, which agreed with an influx of sodium ions during the Na/K-ATPase inhibition. Finally, the cellular heat shock response was investigated using protein-based CEST signals. Heat shock application resulted in a substantial signal decrease by 8.0 +- 0.4% followed by a continuous signal recovery, which agreed with chaperone-induced refolding of misfolded proteins. The proposed NMR techniques combined with the bioreactor system are promising research tools to non-invasively investigate cellular processes by NMR.

Translation of abstract (German)

Die Kernspinresonanz (NMR) ermöglicht die nichtinvasive Untersuchung von Proteinen mit Hilfe der 23Na Tripelquanten (TQ) und 1H Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST) Signale. Wechselwirkungen von Natriumionen mit Makromolekülen erzeugen ein intrazellulär-empfindliches TQ-Signal. Ein TQ-Signalanstieg kann mit einem Verlust der Zellvitalität einhergehen. Ein tieferes Verständnis des TQ-Signals auf zellulärer Ebene ist jedoch notwendig, um einen potenziellen Biomarker für die Zellvitalität zu erhalten. CEST ermöglicht die indirekte Messung von niedrig konzentrierten organischen Verbindungen durch ihren Magnetisierungsaustausch mit Wasser. CEST-Signale von Proteinen in vitro hängen dabei vom Proteinfaltungszustand ab, weswegen diese Signale ein großes Potenzial als ein nichtinvasives diagnostisches Werkzeug für Erkrankungen, wie Krebs und neurodegenerative Erkrankungen, haben. Nichtsdestotrotz muss die Nachweisbarkeit von Denaturierungsprozessen in lebenden Zellen erst noch experimentell gezeigt werden. In dieser Arbeit wurde zuerst eine Abhängigkeit des TQ-Signals vom pH-Wert und dem Proteinfaltungszustand in Proteinlösungen gezeigt. Die Zunahme der Verfügbarkeit von negativ geladenen Gruppen in Proteinen führte zu einem TQ-Signalanstieg während der pH-Variation (224,5 +- 25,1%) oder der Proteinentfaltung (40,7 +-2,3%). Zweitens wurde die zelluläre Antwort auf eine Na/K-ATPase-Blockade mittels verbesserter TQ Signaldetektion beobachtet. Die Perfusion mit 1 mM Ouabain Medium verursachte einen TQ-Signalanstieg um 38,9 +- 4,1%, während die Perfusion mit 0 mM K+ Medium zu einem TQ-Signalanstieg um 83,4 +- 8,9% führte. Beide TQ-Signalanstiege stimmen mit einem Einstrom von Natriumionen während der Na/K-ATPase-Blockade überein. Schließlich wurde die zelluläre Hitzeschockantwort mittels CEST-Signalen von Proteinen untersucht. Die Anwendung eines Hitzeschocks führte zu einer Signalabnahme von 8,0 +- 0,4% gefolgt von einem kontinuierlichem Signalanstieg, der mit einer Rückfaltung von denaturierten Proteinen durch Chaperone übereinstimmt. Die vorgestellten NMR-Techniken kombiniert mit dem Bioreaktorsystem sind erfolgversprechende Forschungsinstrumente zur nichtinvasiven Untersuchung von zellulären Prozessen mittels NMR.