German Title: Die ubiquitin-abhängige Regulierung des WNT Transportproteins EVI/WLS

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Abstract

Cellular communication by WNT signalling is crucial for growth, patterning, and tissue homeo-stasis of metazoan animals and has been associated with various human diseases, such as cancer. The different branches of this signalling cascade are induced after the secretion of WNT ligands by the WNT cargo protein evenness interrupted/Wntless (EVI/WLS). The availa-bility and stability of many proteins involved in the WNT signalling pathways is regulated by post-translational mechanisms. In the absence of WNTs, EVI/WLS is modified with ubiquitin and subjected to endoplasmic reticulum (ER)-associated degradation (ERAD) by the pro-teasome. ERAD is well known to remove misfolded proteins from the ER but can also affect cellular signalling by degrading mature proteins associated with secretory routes. However, the latter type of regulation is not well studied in mammals. In addition, the mechanisms leading to the recognition, ubiquitination, and proteasomal targeting of EVI/WLS remain largely elusive.

To gain insights into how ERAD and ubiquitination components regulate EVI/WLS, I performed a RNAi-based screen on EVI/WLS protein stability and used biochemical and cell biological methods in human cells with diverse genetic backgrounds. I discovered that the ER-membrane associated proteins ERLIN2, FAF2, and UBXN4 are novel components of the EVI/WLS ‘destruction complex’. Mechanistically, ERLIN2 links EVI/WLS to the ubiquitination machinery, while FAF2 and UBXN4 interact with EVI/WLS and VCP, potentially to mediate its extraction from the ER membrane. Surprisingly, I also found that EVI/WLS is ubiquitinated and degraded in cells irrespective of their WNT activity. This K11-, K48-, and K63-linked ubiquitina-tion is mediated by the E2 ubiquitin conjugating enzymes UBE2J2, UBE2K, and UBE2N and leads not only to the regulation of EVI/WLS protein levels, but also influences WNT secre-tion. Analysing the functional impact of EVI/WLS abundance revealed that EVI/WLS protein levels and the secretion of WNT11 influence the invasive capacity of malignant melanoma cells. This suggests that the adaptive regulation of EVI/WLS can be important for the phenotypic manifestation and presumably progression of human malignancies.

In summary, my data shows an unanticipated complex ubiquitination pattern of EVI/WLS and three novel interaction partners, thus providing important details on the post-translational modification and fate of an endogenous ERAD substrate in mammalian cells. The abundance of EVI/WLS is essential for context-dependent WNT ligand secretion and thus gov-erns the malignancy of several tumours, among them melanoma. Targeting EVI/WLS protein levels via its post-translational regulations could be used to treat WNT-dependent diseases.

Translation of abstract (German)

Die Zellkommunikation mittels WNT Signalwegen ist notwendig für das Wachstum, die Musterbil-dung und die Gewebehomöostase aller vielzelligen Tiere. Störungen oder Veränderungen in WNT Signalwegen tragen zu der Entstehung zahlreicher Krankheiten bei, wie beispielsweise Krebs. Die Initiation der WNT Signalkaskaden geschieht durch die Sekretion von WNT Liganden mit Hilfe des Transportproteins evenness interrupted/Wntless (EVI/WLS), wobei viele der beteiligten Proteine posttranslational reguliert werden können. Sind keine WNT Liganden vorhanden, wird EVI/WLS ubiquitiniert und durch den endoplasmatischen Retikulum (ER)-assoziierten Abbau (engl. ER-associated degradation, ERAD) dem Proteasom zugeführt. ERAD dient normalerweise dazu, fehl-gefaltete Proteine aus dem ER zu entfernen, kann aber durch den Abbau funktionaler Proteine auch Signaltransduktionswege beeinflussen. Diese Art der Regulation wurde allerdings in Säugetierzel-len bisher nur wenig untersucht und auch bezüglich der Erkennung, der Ubiquitinierung und der Überführung von EVI/WLS an das Proteasom bleiben viele Fragen offen.

Um die Regulation von EVI/WLS durch Ubiquitinierung und ERAD besser verstehen zu kön-nen, habe ich einen RNAi-basierten Screen von zahlreichen ERAD-assoziierten Faktoren durchge-führt und die Ergebnisse durch biochemische und zellbiologische Experimente in verschiedenen genetischen Hintergründen validiert. Ich habe herausgefunden, dass ERLIN2, FAF2 und UBXN4 am Abbau von EVI/WLS beteiligt sind. ERLIN2 verbindet EVI/WLS mit dem Ubiquitinsystem, wohin-gegen FAF2 und UBXN4 mit EVI/WLS und der ATPase VCP interagieren, vermutlich um EVI/WLS aus der ER Membran zu entfernen. Überraschenderweise wurde EVI/WLS in Zellen unabhängig von deren WNT Aktivität ubiquitiniert und abgebaut. Diese K11-, K48-, und K63-verbundene Ubiquitinierung wurde durch die E2 Ubiquitin-konjugierenden Enzyme UBE2J2, UBE2K und UBE2N gewährleistet und beeinflusste nicht nur die Verfügbarkeit von EVI/WLS, sondern auch die Sekre-tion von WNT Liganden. Weitere Untersuchungen zur Funktionalität von EVI/WLS ergaben, dass die Verfügbarkeit von EVI/WLS und die Sekretion von WNT11 einen Einfluss auf die Invasivität von Melanomzellen hatten. Dies lässt vermuten, dass die Feinregulation von EVI/WLS möglicherweise wichtig für den Verlauf von menschlichen Krankheiten sein kann.

Zusammengefasst zeigen meine Daten ein unerwartet komplexes Muster der EVI/WLS-Ubiquitinierung sowie drei neue EVI/WLS Interaktionspartner, wodurch neue Erkenntnisse hinsicht-lich der posttranslationalen Modifizierung und Verarbeitung von endogenen ERAD Substraten in Säugetierzellen geliefert werden. Dabei ist die Menge an EVI/WLS Protein nicht nur entscheidend für die kontextabhängige Sekretion von WNT Liganden, sondern letztlich für die Malignität verschie-dener Tumoren, wie dem Melanom. Die posttranslationale Regulation von EVI/WLS könnte deshalb neue Ansatzpunkte zur Behandlung von WNT-abhängigen Krankheiten bieten.