English Title: The applicability of the zebrafish embryo (Danio rerio) as a model organism for teratogenicity testing

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Abstract

Ereignisse wie die Minamata-Methylquecksilberkatastrophe und der Contergan-Skandal haben den Fokus verstärkt auf die Entwicklung von Protokollen zur Risikobewertung von chemischen Stoffen gelenkt. Um solchen Forderungen Folge zu leisten, wurden vermehrt In vivo-Toxizitätstest mit den klassischen Säugetiermodellen, beispielsweise der Ratte (Rattus norvegicus) und der Maus (Mus musculus), entwickelt. Die Zulässigkeit dieser Tests wurde wiederum häufiger in Frage gestellt, wodurch die Suche nach neuen Testsystemen zur Verfeinerung und Verbesserung des bisherigen Katalogs an In vivo-Methoden begann. Das Ziel war es, die Unsicherheit der Daten zu reduzieren und letztendlich genauere Vorhersagen für die menschliche Gesundheit zu ermöglichen. Oftmals setzen Teratogenitätstests in frühen Entwicklungsstadien eines Organismus an, da diese zu den empfindlichsten Stadien zählen, welche durch Chemikalien und äußere Einwirkungen gestört werden können. Der Embryo des Zebrabärblings (Danio rerio) beweist in dem Zusammenhang großes Potential, da er neben einer Fülle an Vorteilen im Blick auf die Aufzucht und Anwendbarkeit im Labor auch als alternatives Testsystem gilt, da der Organismus bis 120 Stunden nach der Befruchtung nicht unter die aktuellen EU-Tierschutzbestimmungen fällt. Doch trotz dieser Vorzüge ist die Anwendbarkeit des Zebrabärblings in Teratogenitätstests noch immer nicht vollständig akzeptiert.

Diese Dissertation hat das Ziel, festzustellen, inwieweit der Zebrabärblings-Embryo für allgemeine Teratogenitätstests eingesetzt werden kann. Hierzu wurde er zunächst im „Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test“ (OECD TG 236) auf seine Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen entwicklungs- und reproduktionstoxischen Substanzen getestet. Diese Ergebnisse ermöglichten die Bestimmung einer umfangreichen Liste von phänotypischen Entwicklungsveränderungen, von denen einige zur Prüfung spezifischer Toxizitätsmechanismen weiterverwendet wurden. Substanzen, welche im FET-Test beispielsweise einen Tremor auslösten, wurden im Coiling- und im Schwimmverhaltens-Assay analysiert, um ihre Auswirkungen auf die Verhaltensentwicklung des Embryos zu bestimmen.

Die hier vorgestellten Befunde zeigen, dass der Zebrabärblings-Embryo für Teratogenitätstests grundsätzlich geeignet ist und dass, obwohl die Testmethoden weitere Entwicklung erfordern, der Organismus Einblicke in die frühen morphologischen und neuronalen Entwicklungsveränderungen bietet. Die umfangreiche Liste an Beobachtungen im FET-Test erlaubt es in vielen Fällen, die diesen Veränderungen zugrundeliegenden Wirkmechanismen zu identifizieren. Die Verhaltensexperimente verdeutlichen außerdem, dass der Zebrabärbling auf neurotoxische Wirkstoffe in verschiedenen Entwicklungsstadien reagiert, was sich durch spezifische Veränderungen der Verhaltensmuster zeigt. In Anbetracht der hier vorgestellten Daten empfiehlt sich der Zebrabärblings-Embryo als effektives Modell in Teratogenitätsstudien. Im FET-Test und den Verhaltensexperimente wurden für den Menschen schädliche Substanzen erkannt und stellen im Vergleich zu den traditionellen Tierversuchen eine schnellere, einfacherer und schmerzfreie „In vitro“-In vitro-Methode dar.

Translation of abstract (English)

Incidents, such as the Minamata methylmercury disaster and the thalidomide scandal, have increased the focus on the development of risk assessment protocols. In response, more in vivo toxicity tests have been developed using classical mammalian models, such as the rat (Rattus norvegicus) and the mouse (Mus musculus). The admissibility of these tests, in turn, was increasingly questioned, prompting the search for new test systems to refine and improve the previous catalogue of In vivo methods. The goal was to reduce the uncertainty of the data and ultimately enable more accurate predictions for human health. Teratogenicity testing assesses early developmental stages of an organism, as these are among the most sensitive stages that can be disrupted by chemicals and other substances. The zebrafish embryo (Danio rerio) has proven to hold great potential, as it offers a wealth of advantages in terms of rearing and applicability in the laboratory, as well as being an alternative test system, as the organism is not subject to current EU animal welfare regulations until 120 hours post fertilisation. However, despite these ad-vantages, the applicability of the zebrafish in teratogenicity testing has not yet been definitively decided.

The present doctoral thesis aims to determine the extent to which the zebrafish embryo can be used for general teratogenicity testing. To this end, various developmental and reproductive toxicants were tested in the "Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test" (OECD TG 236), in order to determine its overall sensitivity. These results allowed the determination of an extensive list of macroscopic developmental changes, some of which were further used to test specific toxicity mechanisms. Substances that induced tremor in the FET assay, for example, were analysed in the spontaneous movement assay and swimming behaviour assay to determine their effects on embryo behavioural development. The results presented here demonstrate that the zebrafish embryo is suitable for teratogenicity testing and that, although the methods require further development, the organism provides insight into early morphological and neural developmental changes. The extensive list of observations in the FET test allows in many cases to attribute the mechanisms of action underlying these changes. The behavioural experiments also illustrate that zebrafish respond to neurotoxic agents at different developmental stages, as evidenced by specific changes in behavioural patterns.

In view of the data presented here, the zebrafish embryo proves to be an effective model in teratogenicity studies. The FET test and behavioural experiments have identified sub-stances harmful to humans and provide a faster, simpler, and painless in vitro method compared to traditional animal testing.