Preview

PDF, English - main document Download (12MB) | Lizenz: Targeted 2D- and 3D-cell cultures reveal mechanistic effects of extracellular matrix and stromal cells on the metastatic niche formation and metabolism of cancer cells. by Keller, Florian underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0

Abstract

Primary tumor progression and metastasis are highly dependent on the cancer cell population and its interaction with surrounding stimuli, i.e. extracellular matrix (ECM) and stroma. Therefore, a comprehensive knowledge about processes involved in the remodeling of the ECM during niche formation and the metabolic coupling of cancer cells and stromal cell populations is needed in order to improve cancer treatment. Due to their ease in use and reproducibility, cell culture-based models have been widely used in cancer research. However, common models often lack important aspects of tumor biology, in particular, regarding ECM and stroma. For that reason, this work aimed at novel two- (2D) and three-dimensional (3D) models in mono- and co-culture that enable deeper insights into the role of ECM and stroma in cancer cell biology.

First, the effects of ECM compounds on the growth of 2D-cultures and 3D-spheroids of MDA-MB-231 human breast cancer cells were addressed. This showed that 3D-cultures of this cell line establish stable spheroids only in the presence of ECM supplementation but not in their absence. In parallel, MCF10A human breast epithelial cells were tested to evaluate their transferability towards co-culture modeling with distinct media compositions. This revealed highly altered spheroid morphologies and sizes when adapting mutual mono-culture protocols. In particular, MDA-MB-231 showed increased spheroid growth in enriched media commonly used for MCF10A cells, while the non-cancerous epithelial cells established proliferating subspheroids upon supplementation with basal membrane extract (BME).

Next, the role of ECM on biosynthesis and secretion of the bone metastasis marker, bone sialoprotein (BSP), were studied. Therefore, cultures in cell-repellent wells containing basal membrane extract served as robust 3D-culture model. This showed that BSP expression levels were higher in the presence of BME, Type-I collagen, and proteolytic activity associated with ECM remodeling, implying mechanistic interactions between matrix metalloprotease (MMP) activity, BSP expression and matrix acidification. Experiments with cycloheximide on samples processed with and without permeabilization indicated an induced protein neogenesis with consecutive secretion consistent with latent transforming growth factor beta or matrix MMPs being activated during ECM modulation.

After altered cellular activity of MDA-MB-231 cancer cells based on ECM stimuli was ensured, findings were transferred to HT-29 human colon cancer cells to enhance the significance of the readouts. Changing the cell culture model to an array-based 3D-culture system improved cell-cell interactions and mechano-transduction processes that were rather limited in spheroid cultures based to their compact structures and a lack of stronger physical support. Chip cultures revealed metabolic alterations in both, ECM producing fibroblasts and cancer cells, indicating mechanisms complying with the reverse Warburg effect. During this metabolic coupling process, the aerobic glycolysis is increased in stromal fibroblasts and membrane shuttling of metabolites can favor cancer progression and metastasis.

All 3D-studies were facilitated by progress in optical tissue clearing of intact fixed 3D-cancer cell cultures. Thus, the present work contributed to these novel protocols for cancer cell spheroids and 3D-cell-array cultures.

Altogether, links between ECM-mediated cancer progression and metabolic coupling as well as metastatic niche formation were described in this work using novel cell culture models. Technological advances in both, cell culture methodology and downstream sample analysis were achieved, which yielded new insights on intercellular signaling induced by ECM components or stromal cells. Therefore, considering co-culture compositions and ECM compounds, a promising tool for preclinical trials was established to help improving cancer research.

Translation of abstract (German)

Der Fortschritt primärer Tumore und dessen Metastasierung hängen stark von der Krebszellpopulation und ihren Wechselwirkungen mit umgebenden Reizen wie der extrazellulären Matrix (EZM) und dem Stroma ab. Um die Behandlung von Krebserkrankungen zu verbessern, ist es daher wichtig, umfassendes Wissen über die Nischenbildung und die Kopplung von Stoffwechselwegen zu erlangen, da es in diesen Prozessen zu einer Modellierung der EZM kommen kann. Die Krebsforschung setzt vermehrt auf zellkultur-basierte Modelle, da diese besonders einfach in der Handhabung sind und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Verbreitete Methoden decken aber wichtige Aspekte der Tumorbiologie häufig nicht ab, vor allem in Bezug auf die extrazelluläre Matrix und umgebender Zelltypen werden einige Aspekte nicht immer beleuchtet. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein besonderes Augenmerk auf neue zwei- (2D) und drei-dimensionale (3D) Modelle gelegt, um mit Hilfe von Mono- und Ko-Kulturen zu neuen Erkenntnissen bezüglich der Wechselspiele von Krebszellen und ihrer Umgebung zu gelangen.

Zunächst wurden Effekte von Komponenten der extrazellulären Matrix auf das Wachstum humaner MDA-MB-231 Brustkrebszellen in 2D-Kulturen und 3D-Sphäroiden betrachtet. Dabei zeigte sich eine direkte Abhängigkeit von der EZM, da diese Kulturen nur stabile Sphäroide ausbildeten, wenn eine entsprechende Supplementierung gewährleistet wurde. Gleichzeitig sollte mit Hilfe von humanen MCF10A Brustepithelzellen geprüft werden, ob Ergebnisse, die mit den jeweiligen Mono-Kulturmedien erzielt wurden, auf ein Ko-Kulturmodell übertragen werden können. Es stellte sich heraus, dass die Größe und die Form der einzelnen Sphäroide stark von der verabreichten Supplementierung abhängig waren. Während Kulturen der MCF10A Zellen durch die Zugabe von Extrakten der Basalmembran (BME) zusätzliche Substrukturen ausbildeten, bildeten MDA-MB-231 Zellen einen einzelnen Sphäroiden aus, dessen Wachstum durch ein angereichertes Medium stimuliert wurde.

Danach wurde getestet, wie sich die EZM auf die Biosynthese und die Sekretion von Knochen-Sialoprotein (BSP) auswirkt. Um diesen Marker für Knochenmetastasierung genauer zu untersuchen, wurde ein robustes 3D-Modell verwendet, bei dem die Zellen zusammen mit BME in Wannen mit zellabweisender Oberfläche kultiviert wurden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Expression von BSP mit Hilfe von BME, Collagen Typ-I, oder durch die Applikation proteolytischer Aktivität stimuliert werden kann. Zusammenhänge mit der EZM-Modellierung deuteten dabei mechanistische Effekte an, bei denen die Aktivität von Matrix-Metalloproteasen (MMP), die Expression von BSP und die Ansäuerung der Matrix im direkten Zusammenhang stehen. Die Behandlung von verschiedenen Kulturen mit Cycloheximid und die anschließende Betrachtung von mit und ohne Permeabilisierung gefärbten Proben deuten eine Protein-Neusynthese mit nachfolgender Sekretion an. Dieser Einfluss könnte mit der Aktivierung latenter transformierender Wachstumsfaktoren und MMPs während der EZM Modellierung erklärt werden.

Nachdem sichergestellt werden konnte, dass sich das Verhalten von MDA-MB-231 Krebszellen durch Reize in der extrazellulären Matrix beeinflussen lässt, wurden diese Ergebnisse auf humane HT-29 Darmkrebszellen übertragen. Hierdurch sollte die Aussagekraft der erzielten Befunde gesteigert werden. Durch die Anpassung des 3D-Zellkulturmodells in ein Array-System wurden Zell-Zell-Interaktionen und Prozesse der mechanischen Transduktion verbessert. Ihr kompakter Aufbau und das Fehlen weitere physikalischer Stützen waren limitierende Faktoren für eine entsprechende Untersuchung im zuvor verwendeten Sphäroid-Modell. Die Array-basierten Kulturen zeigten induzierte Abweichungen in der Stoffwechselleistung von Krebszellen und EZM-produzierenden Fibroblasten. Diese Effekte stimmten mit dem Modell des reversen Warburg-Effekts überein, bei dessen Ausbildung Fibroblasten aus dem Tumor-Stroma vermehrt den Stoffwechselweg der aeroben Glykolyse nutzen. In diesem Zusammenhang treten erhöhte Membran-Transporter-Aktivitäten auf und freigesetzte Stoffwechselprodukte können den Krebsfortschritt und die Metastasierung begünstigen.

Alle dreidimensionalen Studien profitierten von Verbesserungen der optischen Gewebeklärung intakter 3D-Kulturen. Daher trug diese Arbeit zur Weiterentwicklung entsprechender Protokolle zur Analyse von Krebszell-Sphäroiden bei und entwickelte neue 3D-Array-Kulturen weiter.

Insgesamt werden verschiedene Einflüsse der EZM auf die biologischen Aktivitäten neuer Zellkulturmodelle in dieser Arbeit beschrieben. Es konnte eine Verbindung von Krebsfortschritt und damit verbundener Stoffwechsel-Kopplung mit Stromazellen auf der einen, und der Bildung von Tumornischen während der Metastasierung auf der anderen Seite aufgezeigt werden. Technologischer Fortschritt wurde erreicht und neue Einblicke in EZM-modulierten Signalen und Zell-Zell-Interaktionen wurden mit Verbesserungen der Zellkulturmethoden und der darauffolgenden Probenanalyse ermöglicht. Damit wurde ein vielversprechendes Instrument für präklinische Studien entwickelt, das dabei helfen kann, die Krebsforschung zu verbessern.